2.3. 分析方法

分析前，從反應器取出的水樣立即通過0.22微米膜過濾。使用高效液相色譜（LC-20，Shimadzu，日本）與真實標準品鑒定和定量吡啶。流動相為水-甲醇（3:7，v/v），流速為1.0毫升/分鐘，柱溫為35°C。所有樣品的進樣體積為10微升。使用Inerstil ODS-SP C18（4.6毫米×250毫米，5微米）柱（Shimadzu，日本）進行反相分離，檢測為分光光度法，波長254納米。NH4-N根據中國國家環(huán)保局（NEPA）標準方法（1997）分析。樣品的TOC濃度使用TOC分析儀（vario TOC，Elementar，德國）測量。乙酸濃度通過離子色譜儀（ICS-2100，DIONEX，英國）使用Ion Pac® As11-HC（4毫米×250毫米）柱和抑制電導檢測器測定。掃描電子顯微鏡（SEM）觀察和電化學監(jiān)測根據Ho等人（2009）和Shen等人（2012）進行。使用微電極自動化系統(tǒng)（PA2000，Unisense，丹麥）測量陽極生物膜中的氧濃度和pH值分布。

吡啶和TOC去除效率根據Shen等人（2015）確定，氨形成效率（FE_{NH4+-N}）由以下公式計算：

使用Excel計算平均值和標準偏差。此外，為評估不同處理間是否存在顯著差異，使用SPSS軟件（版本19.0，SPSS Inc.，美國）進行單因素方差分析（ANOVA）檢驗。p值小于0.05被認為具有統(tǒng)計學顯著性。

在實驗不同階段收集五個樣品，分別標記為S0（初始接種物）、S1和S2（電流刺激前從陽極和陰極收集）、S3和S4（長期實驗結束后電流刺激后從陽極和陰極收集）。用磷酸鹽緩沖鹽水（pH=7.0）洗滌后，使用FastDNA SPIN kit（MP Bio-medicals，美國）根據制造商說明提取每個樣品的基因組DNA。使用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對細菌16S rRNA的V4區(qū)域進行PCR擴增。PCR產物根據標準協(xié)議通過Illumina Miseq測序平臺進行測序。

3. 結果與討論

3.1. 啟動過程

在啟動期最初37天，無電流供應下，厭氧反應器中進水濃度為100毫克/升時，吡啶去除效率在前17天末高于95%（圖1）。然而，當吡啶濃度增加至300毫克/升時，僅約60%，表明高吡啶濃度對厭氧條件下其降解有負面影響。在38天提供小于0.3毫安的小電流后，陽極電位從-244±4.5毫伏增加至-150±9.5毫伏，而陰極電位從-360±5.5毫伏降低至-800±15毫伏。有趣的是，吡啶去除和NH4-N形成效率顯著從61.1%和39.3%（37天無電流時）增加至98.3%和60.7%（55天有電流時）。純電解系統(tǒng)中吡啶去除效率僅為2.3±1.0%，表明小電流電解過程對吡啶的降解幾乎可忽略。NH4-N形成是吡啶環(huán)裂解的關鍵證據，因為先前研究表明吡啶環(huán)中的氮常在吡啶生物降解過程中轉化為NH4-N。然而，測得的NH4-N僅為吡啶中氮的60%，這可能是因為吡啶降解產生的大部分NH4-N用于生物質合成。此外，電流供應后超過95%的TOC被去除，而厭氧條件下僅約57%的TOC被去除，表明電流刺激下厭氧條件下吡啶幾乎完全礦化。先前研究表明，電化學刺激可通過提供電極作為陽極電子受體或陰極電子供體加速有機污染物的降解。例如，電化學刺激可增強洛克沙胂生物降解和礦化為無機砷，促進通過物理化學處理廢水去除砷。值得注意的是，微生物電子轉移對于電化學刺激過程中洛克沙胂降解至關重要。在本研究中，厭氧系統(tǒng)中的陽極在吡啶降解中起關鍵作用，因為吡啶抵抗微生物還原降解但更容易在陽極氧化降解中屈服。此外，在處理吡啶污染物時，電極可對微生物提供連續(xù)和精細的刺激。

圖1. 厭氧反應器啟動期間吡啶降解、總有機碳（TOC）去除及氨氮生成變化曲線

3.2. 關鍵操作參數的影響

3.2.1. 進水吡啶濃度

如圖2a所示，反應器在進水吡啶濃度300-500毫克/升范圍內保持良好去除性能，其中幾乎100%吡啶和95% TOC（p>0.05）被去除，約60% NH4-N（p>0.05）產生，表明反應器性能變化不顯著。然而，當進水吡啶濃度增加至600毫克/升時，吡啶去除效率顯著從100.0%降低至89.3±1.4%（p=0.009），且NH4-N形成效率降低10%（p=0.012）。類似現(xiàn)象也在先前研究中觀察到，這可歸因于更高吡啶濃度下的更高頑固性和毒性。應指出，原始工業(yè)廢水中吡啶濃度通常在20-500毫克/升范圍內。電刺激厭氧系統(tǒng)中最大吡啶去除率遠高于2.28摩爾/立方米·天，高于傳統(tǒng)缺氧或厭氧系統(tǒng)。例如，存在電子受體即NO3時缺氧條件下吡啶去除率為0.76摩爾/立方米·天。電刺激厭氧系統(tǒng)中的速率遠高于缺氧條件1.26摩爾/立方米·天。在接種反硝化細菌的厭氧系統(tǒng)中，吡啶去除率僅為1.25摩爾/立方米·天（Rhee等人，電子受體即NO3時為0.76摩爾/立方米·天。馴化活性污泥在缺氧條件下吡啶去除率為1.26摩爾/立方米·天。在接種反硝化細菌的厭氧系統(tǒng)中，廢水中。

圖2. (a)吡啶濃度、(b)施加電流、(c)水力停留時間、(d)乙酸投加量對厭氧反應器中吡啶降解、TOC去除及氨氮生成的影響

3.2.2. 施加電流

在階段III，通過設置其值從0到0.4毫安評估施加電流對反應器性能的影響。無電流供應時，吡啶、TOC去除和NH4-N形成效率分別為66.2±1.8%、64.4±0.8%和39.6±2.3%，高于系統(tǒng)啟動期間觀察到的值。對此觀察的可能解釋是適當的直流電可刺激微生物活性并促進生物膜形成。隨著施加電流從0增加至0.3毫安，陽極電位從-244±4.5毫伏增加至-150±9.5毫伏。吡啶、TOC去除和NH4-N形成效率 consequently 增加至100.0%（p=0.003）、96.1±1.2%（p=0.003）和60.1±2.1%（p=0.01）（圖2b）。此觀察進一步表明電刺激厭氧系統(tǒng)可促進吡啶降解。然而，施加電流進一步增加至0.4毫安對反應器性能有顯著負面影響。陽極電位急劇增加至250±30毫伏，表明陽極上的電化學活性微生物可能在此條件下被嚴重抑制。因此，吡啶、TOC去除和NH4-N形成效率顯著降低至90.2±1.7%（p<0.001）、88.9±1.8%（p<0.001）和54.0±1.0%（p=0.002）。以上結果強有力地證明，當施加合適電流到厭氧系統(tǒng)時，反應器性能可被抑制在此條件下。因此，吡啶、TOC去除和NH4-N形成效率顯著降低至90.2±1.7%（p<0.001）、88.9±1.8%（p<0.001）和54.0±1.0%（p=0.002）。以上結果強有力地證明，當施加合適電流到厭氧系統(tǒng)時，反應器性能可被增強，優(yōu)化厭氧系統(tǒng)中微生物的馴化。

3.2.3. HRT

HRT是調節(jié)厭氧系統(tǒng)性能的重要參數。如果HRT過長，系統(tǒng)效率降低且建設成本增加。在階段IV，在恒定施加電流0.3毫安下評估五個不同HRT的系統(tǒng)性能。如圖2c所示，當HRT在48-72小時范圍內變化時，系統(tǒng)在吡啶和TOC去除方面顯示穩(wěn)定性能。隨著HRT從72小時減少至48小時，吡啶和TOC去除效率輕微從100.0%降低至95.2±1.4%，至98.1±1.0%（p=0.142）和92.4±2.1%（p=0.417），表明反應器性能變化不顯著。系統(tǒng)中NH4-N形成效率保持高于58%（p=0.581）。然而，隨著HRT減少至36小時，吡啶和TOC去除效率實質性降低至86.3±2.3%（p=0.004）和79.8±0.8%（p=0.005）。此外，NH4-N形成效率降低至49.3±2.5%（p=0.029）。此結果與先前觀察不一致，即中間體NH4-N在微生物燃料電池中36小時內完全消耗。此觀察可歸因于吡啶作為厭氧系統(tǒng)中的底物，對微生物生長和存活有負面影響。HRT進一步從36小時減少至24小時引起反應器性能在吡啶降解（p=0.006）和TOC去除（p=0.002）以及NH4-N形成（p=0.021）方面顯著惡化。隨著HRT減少，厭氧反應器性能下降可能由于較短HRT與較高吡啶負荷率可能嚴重抑制陽極呼吸細菌進行乙酸氧化。先前研究表明，高吡啶負荷下微生物活性可能被嚴重抑制。

3.2.4. 乙酸鈉投加量

向厭氧反應器補充共底物如乙酸鈉很重要，因為它使微生物適應有毒吡啶，此外維持3.2.4. 乙酸鈉投加量 9.6毫摩爾，吡啶降解和TOC去除效率在電輔助厭氧系統(tǒng)中經歷輕微增加，從85.6±1.7%和82.1±2.0%至89.5±1.3%（p=0.285）和85.2±0.9%（p=0.312）。這可能歸因于乙酸代謝微生物種群增加。然而，當乙酸鈉投加量從9.6增加至16毫摩爾時，系統(tǒng)中吡啶和TOC去除效率顯著降低至75.2±1.6%（p=0.009）和74.1±1.6%（p=0.012）。高乙酸鈉投加量下反應器性能惡化表明高乙酸鈉投加量不利于吡啶降解。這可能歸因于乙酸對吡啶降解有更強競爭效應。同時，乙酸去除效率在整個測試期間保持約100%，表明過量乙酸可在厭氧系統(tǒng)中完全消耗。NH4-N形成效率也受乙酸鈉投加量影響。無乙酸添加時NH4-N形成效率高達56.2±2.2%，但當乙酸濃度為16毫摩爾時降低至15.0±1.4%（p=0.04）。對此響應的可能解釋是乙酸對微生物生長的積極影響，伴隨NH4-N消耗增加。以上結果清楚顯示，維持適當乙酸鈉投加量可增強電流刺激下厭氧反應器中吡啶降解。這是非常有用的觀察，因為實際廢水中除吡啶外通常存在易生物降解有機物（如葡萄糖、乙酸等）。