血紅蛋白中結合O2的酸敏脫氧。在5毫升pH=7.4和pH=6.5的緩沖介質中加入MS NPs(0.1M，20微升)20分鐘后，溶液的吸收率在450到650納米之間(對照，pH=7.4緩沖液；MS NPs，pH=7.4緩沖液+MS NPs；H+，pH=6.5緩沖液；MS NPs+H+，pH=6.5緩沖液+MS NPs)的吸收率。實驗進行了三次，并使用了具有代表性的紫外可見吸收光譜。通常情況下，HbO2在542和577納米波長處有兩個吸收峰，而脫氧血紅蛋白在555納米波長處有一個吸收帶。

細胞培養。所用細胞系均來自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫，并通過DNA指紋、同工酶檢測和支原體檢測對其進行了系統鑒定。所有這些細胞系都經過充分擴增，以冷凍瓶的形式保存在液氮中，每三個月從同一批冷凍瓶中回收使用。NRK-52E大鼠腎近曲小管細胞系、MCF-7人乳腺癌細胞系和Hela人宮頸癌細胞系在高糖DMEM(Gibco)培養基中培養，BRL-3A大鼠肝臟細胞系和4T1小鼠乳腺腫瘤細胞系在RPMI 1640培養基(Gibco)中培養。培養基中含有鏈霉素(100毫克/毫升)、青霉素(100單位/毫升)和10%熱滅活胎牛血清，培養溫度為37℃，濕度為5%CO2。所有細胞系在培養過程中均未進一步檢測支原體污染。

用光學探針評估細胞缺氧情況。首先將MCF-7細胞(1×105個細胞，1ml DMEM，pH=7.4)播種在CLSM專用培養盤中，讓其在5%的CO2氣體環境中于37℃下附著過夜。然后將細胞與濃度為10μg/ml的[Ru(dpp)3]Cl2(Sigma-Aldrich)培養12小時，再用PBS沖洗三次以除去游離的[Ru(dpp)3]Cl2。在不同處理(pH=7.4的培養基、pH=7.4含10mM MS NPs的培養基和pH=6.5含0、2、5和10mM MS NPs的培養基)中加入1毫升新鮮DMEM培養基后，MCF-7細胞在共聚焦培養皿中于37℃密封培養2小時。使用Unisense氧微電極測量培養基中溶解氧的濃度變化。用激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000)檢測[Ru(dpp)3]2+的熒光(λex=450nm，λem=610nm(ex，激發；em，發射)來評估細胞內的氧氣水平。每組分別有五個和兩個獨立的培養皿進行溶氧水平測量和熒光成像。

18F-MISOPET/CT評估MSNP誘導的體外缺氧。最初的[18O]-misonidazole購自華誼科技。隨后的[18F]-MISO是在回旋加速器PETtrace(GE)上制備的，即用質子輻照1.5毫升銀靶中的[18O]-misonidazole，實現18O(p,n)18F核反應。首先將MCF-7細胞(1×107cells，10ml DMEM，pH=7.4)接種到培養盤中，在37℃和5%CO2氣體條件下放置過夜。在與10毫升新鮮DMEM培養基密封共培養后，分別加入不同處理(pH=7.4的培養基、含有10mM MS NPs的pH=7.4的培養基和含有0、2、5mM MS NPs的pH=6.將細胞在37℃下再培養2小時后，立即清洗、胰蛋白酶化、收獲細胞并用1ml PBS重懸于Eppendorf微離心管(1.5ml)中，在10μl生理鹽水中加入10μCi 18F-MISO。進一步共孵育15分鐘后，用PBS充分洗滌細胞，并在2,000rpm轉速下離心沉淀5分鐘，然后進行PET/CT成像。

體外癌細胞饑餓。將MCF-7細胞(每孔100μl DMEM培養液中含1×104個細胞)一式六份地接種到96孔微孔板中，并讓其粘附過夜。pH=6.5的酸化培養基是通過加入濃度約為12mM的鹽酸獲得的，鹽酸對細胞生長的影響微乎其微。然后用含有0、2、5和10mM MS NPs的pH=6.5的新鮮培養基取代培養基。在密封培養后的特定時間間隔內，用Unisense氧微電極測量溶解氧水平，并用典型的MTT法(MTT，3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑)檢測隨時間變化的細胞活力(vt)。細胞生長率(gt(%))用公式(8)計算：

其中v0是在沒有進一步培養的情況下立即測量的相應細胞活力。在HeLa和4T1細胞系上也進行了類似的處理，以估計MSNP介導的脫氧對細胞饑餓的普遍性。在給定時間(1小時和4小時)收集的DOA饑餓MCF-7細胞用2.5%戊二醛和1%鋨酸固定、脫水、包埋，然后切成超薄切片，用于Bio-TEM(JEM-1400+)觀察細胞內線粒體。

體外非接觸脫氧。為了模擬非接觸脫氧，將含有MS NPs的開放式微離心管與培養盤內的細胞共同培養。簡言之，將MCF-7細胞(1×105個細胞，2毫升pH=7.4的DMEM)接種到培養盤中，并讓其附著過夜。然后，將裝有1毫升濃度為0、2、5和10毫摩爾MSNP緩沖溶液(pH=6.5)的微離心管與培養盤內的細胞共培養。用Unisense氧微電極測量微離心管內溶液和培養基外的溶解氧水平(每個時間點n=3)。這些原本密封的圓盤在測量后無法復原。密封培養24小時后，立即將細胞胰蛋白酶化、收獲、沖洗并重懸于500μl含有2μM Annexin V-FITC和4.5μM碘化丙啶(PI，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒)的結合緩沖液中。在黑暗中染色20分鐘后，用流式細胞儀對細胞進行分析。實驗一式三份，獨立進行。

動物。用平均年齡為7周(20克)的雌性BALB/c小鼠進行4T1腫瘤異種移植和相應的體內腫瘤饑餓療法評估。平均年齡為6周(20克)的雌性昆明小鼠用于評估MS NPs靜脈注射的潛在毒性。所有小鼠均購自中國科學院上海實驗動物中心。所有動物實驗均按照復旦大學實驗動物管理委員會批準的實驗動物護理規程進行。實驗動物隨機分配，每籠五只，12h光/暗逆轉周期。

腫瘤模型。本研究采用了一種具有高度致瘤性和侵襲性的可移植小鼠4T1乳腺腫瘤模型。在BALB/c小鼠大腿皮下接種懸浮于100μl PBS中的1×106個4T1細胞，然后繼續喂養直到腫瘤體積達到100-130 mm3(腫瘤接種后10d)，以制備皮下4T1異種移植腫瘤模型。雙側和單側4T1異種移植腫瘤BALB/c小鼠分別通過靜注和靜脈注射DOA進行腫瘤饑餓治療。