3.2 H2-MBs可以通過超聲成像可視化。

由于MBs是增強超聲成像最常用的對比劑，因此檢查了H2-MBs在體外和大鼠心臟中的成像效果。結果表明，H2-MBs引起了有效的超聲回波響應，超聲信號的強度與濃度成正比（圖2a）。定量分析顯示，超聲信號的強度分別為1×105、1×106、1×107、1×108和1×109個H2-MBs/mL時分別為43.01±1.29、57.86±1.45、88.29±0.76、114.68±0.74和161.04±1.48 dB（圖2b）。此外，還比較了大鼠心臟左心室（LV）注射H2-MBs前后的成像效果，結果顯示注射H2-MBs后超聲信號顯著增強，與注射前相比有顯著增強（圖2c）。定量分析顯示，H2-MBs注射后信號強度迅速增加，注射后2分鐘達到最大水平（123.39±6.34 dB），然后在5分鐘后下降至87.86±8.12 dB（圖2d）。此外，我們發現H2-MBs可以進入大鼠心肌組織（圖2e）。注射H2-MBs后，心肌組織的超聲信號強度比注射前增加了2.83倍（P<0.01）（圖2f）。高能量破壞脈沖能夠破壞H2-MBs，并導致超聲信號強度顯著降低，證實了心肌組織中存在H2-MBs（圖S5）。

圖2.H2-MBs的超聲信號檢測。（a）H2-MBs分散在各種濃度（5×105、5×106、5×107、5×108和5×109/mL）的PBS中的超聲圖像。使用Vevo 2100超聲成像系統進行成像。（b）PBS中H2-MBs的超聲信號強度的定量分析。（c）大鼠心臟LV中H2-MBs在靜脈尾部注射H2-MBs前后的超聲圖像。使用Vevo 2100超聲成像系統進行成像（n=3）。上排，注射H2-MBs前；下排，注射H2-MBs后；左側面，B模式圖像；右側面，對比模式圖像；LV，左心室（點線循環）。（d）H2-MBs注射進入大鼠后300秒的時間-強度曲線。箭頭表示MB注射的時間。（e）大鼠心肌組織中H2-MB輸送的超聲圖像。使用Philips IE33超聲機進行成像。左側，注射H2-MBs前；右側，注射H2-MBs后；LV，左心室（紅色循環）；IVS，心室間隔（藍色循環）；RV，右心室（綠色循環）。箭頭表示靜脈注射H2-MBs后H2-MB輸送到大鼠心肌組織中的情況。（f）H2-MBs的超聲信號強度的定量分析（n=3）。**P<0.01。數據表示平均值±s.d.

3.3 H2-MBs限制心肌梗死面積。

然后，我們調查了不同劑量的H2-MBs對心肌缺血再灌注損傷后梗死面積的影響。大鼠經歷30分鐘的缺血和24小時的再灌注。左冠狀動脈（LCA）閉塞后，通過心電圖（ECG）S-T段抬高確認缺血（圖S6），然后在再灌注前將H2-MBs或載體以低劑量（4×109個泡沫）或高劑量（2×1010個泡沫）濃度注入尾靜脈。圖3a顯示了載體或H2-MB（高劑量）處理的大鼠的代表性橫截面。評估梗死面積顯示，高劑量H2-MBs顯示出比低劑量H2-MBs更顯著的細胞保護作用（P<0.01）（圖3b）。接受高劑量H2-MBs的大鼠顯示出12.81±3.21％的梗死面積，而與接受載體處理的大鼠（INF/LV：42.67±2.60％）相比，梗死面積減少了69.97％。相比之下，接受低劑量H2-MBs的大鼠顯示出較少的細胞保護作用，梗死面積為26.21±3.10％，僅減少了38.57％。我們還檢查了高劑量H2-MBs對經歷30分鐘缺血和3小時再灌注的大鼠的保護作用，梗死面積評估顯示梗死面積減少了28.06％（P<0.05）（圖3c）。

圖3.H2-MBs預防心肌梗死。（a）給予對照微泡（左）或H2-MBs（右，高劑量）處理的大鼠經TTC染色的心肌連續切片的代表性圖像。被染色陽性（紅色）的組織代表活力心肌。未染色陽性（白色）的心肌代表梗死組織。（b）對于接受假手術處理的、接受車輛處理的或接受H2-MB處理的大鼠（低劑量，每只大鼠4×109氣泡；高劑量，每只大鼠2×1010氣泡）在LCA缺血30分鐘和再灌注24小時后的心肌梗死面積的定量測定。接受H2-MB處理的大鼠顯示出INF/LV顯著減少（n=7）。*P<0.05，**P<0.01。數據表示平均值±s.d。（c）對于接受假手術處理的、接受對照MB處理的或接受H2-MB處理的大鼠在LCA缺血30分鐘和再灌注3小時后的心肌梗死面積的定量測定；每只H2-MB處理的大鼠使用2×1010個H2-MBs。發現了類似的保護作用（n=5）。**P<0.01。數據表示平均值±s.d.

3.4 H2-MBs保護LV結構和功能。

為了確定H2-MBs對病理性LV重塑的影響，使用超聲心動圖監測了LV形態和功能，在經歷30分鐘的LCA缺血和24小時的再灌注后。與假手術處理的大鼠相比，載體處理的大鼠顯示出心肌梗死后不良的病理性重塑。值得注意的是，在再灌注前注射H2-MBs可以減輕心肌梗死后的病理性重塑（圖4a）。此外，接受H2-MBs處理的大鼠的左室舒張末期直徑（LVEDD）和左室收縮末期直徑（LVESD）與接受假手術處理的大鼠相比沒有顯著增加。相反，在心肌缺血再灌注后，接受載體處理的大鼠顯示出顯著增加的LVESD和LVEDD值（圖4b）。此外，接受載體處理的大鼠在心肌缺血后顯示出21.68％和15.81％的射血分數和短軸分數減少，而接受H2-MBs的大鼠顯示出8.44％和7.21％的射血分數和短軸分數減少，分別較少（圖4c）。

圖4.H2-MBs減少不良的LV重塑。（a）接受假手術處理（假手術）、缺血再灌注對照微泡處理或缺血再灌注H2-MBs處理的大鼠的代表性M模式超聲心動圖像。對每組的M模式超聲圖像的測量是在缺血再灌注后48小時進行的。使用裝備有MS-250掃描頭探頭的Vevo 2100系統進行成像，掃描速度為1000 Hz，頻率為21 MHz。刻度條（垂直），4 mm。（b）基于超聲心動圖像，確定了LV尺寸，包括左室舒張末期直徑（LVEDD）和左室收縮末期直徑（LVESD）（n=5）。**P<0.01。數據表示平均值±s.d。（c）與對照組相比，H2-MB處理的大鼠的心臟收縮功能（FS％）和射血分數（EF％）顯著改善（n=5）。**P<0.01。數據表示平均值±s.d。