摘要：缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因。氫氣（H2）作為一種抗氧化劑，已經(jīng)顯示出在預(yù)防和治療缺血再灌注引起的致命損傷方面具有巨大潛力。然而，由于H2在水中溶解度較低，在血液和受損組織中的生物利用度較差。在這里，我們開發(fā)了一種超聲可視的H2傳遞系統(tǒng)，通過將H2裝載在微泡內(nèi)（H2-MBs）來防止心肌缺血再灌注損傷。使用該系統(tǒng)，可以在常溫和常壓條件下大大提高單位體積中的H2濃度。H2-MBs可以在超聲成像系統(tǒng)中進(jìn)行可視跟蹤，并能有效釋放其治療氣體。在缺血再灌注開始時(shí)在活體系統(tǒng)中輸注H2-MBs會(huì)導(dǎo)致明顯減小的梗死區(qū)大小和病理重塑。進(jìn)一步分析表明，這種方法顯著抑制了心肌細(xì)胞凋亡，并減少了心肌缺血再灌注大鼠中的心肌炎癥和氧化損傷。這些結(jié)果表明，H2-MBs是一種有前途的H2基治療應(yīng)用的可視傳遞系統(tǒng)。

1引言

心肌缺血再灌注損傷已被廣泛接受為組織破壞和可能的心力衰竭刺激。當(dāng)冠狀動(dòng)脈的一個(gè)或多個(gè)分支狹窄或閉塞時(shí)，心臟將失去氧氣血液供應(yīng)，隨后的灌注和再氧化通常會(huì)導(dǎo)致組織損傷加劇。病理上，缺血再灌注損傷的一個(gè)潛在機(jī)制是受損心肌組織中活性氧自由基（ROS）的過度產(chǎn)生，特別是在再灌注的最初幾分鐘內(nèi)。ROS的產(chǎn)生觸發(fā)線粒體通透性過渡孔的開放，并導(dǎo)致一系列病理過程，包括各種細(xì)胞死亡程序、微血管功能障礙和炎癥級(jí)聯(lián)。

迄今為止，已經(jīng)嘗試使用一氧化氮、一氧化碳和硫酸氫鹽等治療氣體來減輕心肌缺血再灌注損傷。大多數(shù)這些技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室中表現(xiàn)出了前景，但在臨床應(yīng)用中的結(jié)果則不那么令人鼓舞。一個(gè)關(guān)鍵問題源于這些氣體的固有毒性。最近，氫氣（H2），作為最知名的分子之一，被提出對(duì)缺血再灌注損傷引起的器官功能障礙具有潛在的預(yù)防和治療作用。與其他治療抗氧化劑相比，H2的有效性已經(jīng)在其他模型中廣泛證明。與其他治療抗氧化劑相比，H2具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，包括：（i）其選擇性減少最細(xì)胞毒性的ROS羥自由基，并在不干擾代謝氧化還原反應(yīng)或破壞其他ROS參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和其他生理作用的情況下有效保護(hù)細(xì)胞；（ii）能夠穿透生物膜并擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核中（其快速的氣態(tài)擴(kuò)散可能使其在減少細(xì)胞毒性自由基方面非常有效）；（iii）更重要的是，H2是一種對(duì)人類沒有明顯副作用的安全氣體。

傳統(tǒng)上，以下三種策略用于提供H2治療應(yīng)用：（i）直接吸入H2氣體，（ii）飲用溶解在水中的氫氣，或（iii）靜脈/腹腔注射氫氣飽和鹽水。然而，所有傳遞策略的效果都取決于H2在水、鹽水或血液中的溶解度。不幸的是，H2在水溶劑中溶解度較低，導(dǎo)致其在血液和受損組織中的生物利用度較差。此外，H2的易燃性在制備含H2配方時(shí)造成了巨大的困難和安全隱患。此外，目前尚無可用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的圖像引導(dǎo)的H2傳遞系統(tǒng)。這些限制激發(fā)了尋找新的、安全的H2傳遞系統(tǒng)以有效治療的動(dòng)力。

微泡（MBs）是一種充滿氣體的小型微球體。長期以來，微泡因其在超聲診斷中作為造影劑的臨床應(yīng)用而備受關(guān)注。除此之外，微泡還是重要的藥物遞送載體，能夠在血液循環(huán)中穩(wěn)定攜帶藥物并具有多種治療應(yīng)用。藥物可裝載在微泡外殼上、嵌入外殼基質(zhì)中或填充到內(nèi)部空腔。近期研究報(bào)道了微泡作為封裝治療性氣體載體的應(yīng)用。本文通過大鼠模型實(shí)驗(yàn)，我們首次展示了載氫微泡（H2-MBs）作為抗氧化劑預(yù)防心肌缺血-再灌注損傷的潛力。

2材料和方法

2.1 H2-MBs的制備

以氯仿為溶劑，將購自Avanti Polar Lipid公司的1,2-二硬脂酰-sn-甘油磷酰膽堿（DSPC）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2000]（季銨鹽，DSPE-PEG2000）按摩爾比90：10混合。將溶劑用穩(wěn)定的氮?dú)饬髡舭l(fā)到玻璃管上形成薄膜。然后將磷脂膜置于真空下約2小時(shí)，完全去除溶劑。然后，將干燥的磷脂膜在60℃下與含有甘油、1,2-丙二醇和0.1M三聚氰胺緩沖液的5mL緩沖液中水合，體積比為10：10：80，然后超聲處理直至脂質(zhì)膜完全分散。隨后，將超聲處理的磷脂懸濁液轉(zhuǎn)移到密封的4mL玻璃瓶中（每瓶約1mL），并使用自行設(shè)計(jì)的裝置將瓶中氣體用八氟丙烷（C3F8）置換。將含有磷脂懸濁液和C3F8的瓶子用振蕩器（MONITEX膠囊攪拌器，轉(zhuǎn)速4500 rpm）機(jī)械振動(dòng)45 s，得到對(duì)照MBs（載體）。為制備H2-MBs，通過1mL注射器向倒置的瓶中注入一定量的H2，然后通過另一個(gè)針頭擠出較重的C3F8氣體。然后，像上面提到的那樣，對(duì)這些瓶子進(jìn)行機(jī)械振動(dòng)，以獲得H2-MBs。

2.2 H2釋放曲線的測(cè)量

根據(jù)先前的研究，使用針式氫氣電極（Unisense）在磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）和血液中測(cè)量H2釋放曲線。簡要地說，向5mL PBS中加入0.2 mL H2-MBs或?qū)φ誐Bs（載體）。然后，通過將針式氫氣電極浸入MB懸浮液中并實(shí)時(shí)記錄數(shù)據(jù)來確定H2釋放曲線。對(duì)于體內(nèi)H2釋放曲線，將針式氫氣電極插入五只健康大鼠的左心室（動(dòng)脈血），并通過靜脈注射向大鼠注入2×1010 H2-MBs或?qū)φ誐Bs。然后連續(xù)記錄血液中H2的濃度。

2.3超聲成像

使用專用于小動(dòng)物的高分辨率超聲成像系統(tǒng)（Vevo 2100；VisualSonics，加拿大多倫多）或使用IE33超聲機(jī)（Philips Medical Systems，MA）對(duì)H2-MBs進(jìn)行超聲成像。對(duì)于體外線性B模式超聲成像實(shí)驗(yàn)，向透明袋中添加各種濃度（5×105，5×106，5×107，5×108或5×109/mL PBS）的H2-MBs；PBS用作對(duì)照。然后將袋子浸入水浴中，使用Vevo 2100成像系統(tǒng)進(jìn)行超聲成像，參數(shù)如下：探頭MS-400；增益25 dB；焦深4?6 mm；發(fā)射功率30%；機(jī)械指數(shù)0.2；動(dòng)態(tài)范圍60 dB，幀率25 Hz；中心頻率40 MHz。對(duì)于體內(nèi)增強(qiáng)超聲成像實(shí)驗(yàn)，將三只健康大鼠麻醉后，以1.5%異氟醚吸入，固定在仰臥位，然后用Vevo 2100成像系統(tǒng)對(duì)大鼠的左心室腔內(nèi)的H2-MBs進(jìn)行成像，參數(shù)如下：探頭MS-250；增益20 dB；焦深21?23 mm；發(fā)射功率10%；機(jī)械指數(shù)0.2；動(dòng)態(tài)范圍40 dB，幀率17 Hz；中心頻率18 MHz。為了檢測(cè)已輸送到心肌組織中的H2-MBs，使用Philips IE33超聲機(jī)對(duì)心臟進(jìn)行成像，參數(shù)如下：探頭S5-1；增益44 dB；焦深1?3 cm；動(dòng)態(tài)范圍50 dB；幀率40 Hz；中心頻率3 MHz。信號(hào)強(qiáng)度由QLAB軟件定量。