摘要

硫醇雙加氧酶是一類非血紅素單核鐵蛋白，屬于杯蛋白超家族。2014年，科學家發現奇異變色桿菌B4的巰基琥珀酸雙加氧酶（Msdo）是另一種催化巰基琥珀酸（MS）轉化為琥珀酸和亞硫酸鹽的細菌半胱氨酸雙加氧酶（Cdo）同源物。為深入探究酶活性關鍵氨基酸殘基的作用機制，研究人員構建并分析了七個酶變體：(i)三個變體分別將保守的組氨酸殘基H93和H95替換為亮氨酸，推測前者可能對鐵（II）輔因子的配位至關重要，后者則對底物在活性位點的定位起重要作用；而H163的替換同樣被證實為必需，但對應的酶變體完全失活，證實了這些殘基對酶活性的關鍵作用；（ii）C100S突變同樣導致酶失活，表明該位點對蛋白質的穩定性或活性具有重要影響；（iii）對于真核生物Cdo，研究者推測其底物定位存在氫鍵網絡，而Msdo中相應的氨基酸殘基基本構成該網絡。盡管MsdoQ64A突變體的Km值較野生型0.06 mM顯著升高至0.29 mM，但其特異性活性未見明顯變化。（四）MsdoR66A突變體即使在高酶量條件下仍表現出極低活性，表明該位點可能對催化作用至關重要。（五）Y165F突變體的特異性酶活性為10.22μmol min?1 mg?1 protein，Km值仍保持在0.06 mM，與野生型酶高度相似。該位點對應人類Cdo的Y157，屬于催化三聯體結構域，推測參與底物定位。值得注意的是，Msdo中可能由其他位點承擔類似功能，因為Y165缺失并未引發顯著影響。

1.引言

有機硫化合物巰基琥珀酸（MS）被廣泛應用于各個領域，例如作為量子點的穩定劑（量子點是醫學研究中特別重要的工具），或在頭發化妝品領域用于還原角蛋白以建立永久性波浪。此外，MS被討論作為合成聚硫酯（PTE）的有前途的前體底物候選物。PTE是不可生物降解的生物聚合物，由于其性質如溶解性降低和熱穩定性優于更常見的聚羥基鏈烷酸酯生物聚合物，因此對潛在工業應用感興趣。因此，在Variovorax paradoxus菌株B4中闡明了MS的細菌代謝，旨在鑒定一種可能適用于PTE生產的新菌株。V.paradoxus B4的巰基琥珀酸雙加氧酶（Msdo）被描述為一種新型細菌硫醇雙加氧酶，是該細菌中MS降解的關鍵酶。該酶催化MS的氧依賴性轉化為亞磺基琥珀酸，后者自發脫亞磺基生成琥珀酸和亞硫酸鹽。Msdo屬于杯蛋白超家族，其特征是共同的β-桶核心以及部分保守的杯蛋白motif。

在真核生物中，半胱氨酸雙加氧酶（Cdo）是杯蛋白超家族最重要的代表之一，它通過催化半胱氨酸不可逆轉化為半胱氨酸亞磺酸，對調節細胞內半胱氨酸濃度至關重要。由于一些嚴重的神經系統疾病與半胱氨酸濃度升高及由此導致的Cdo活性缺乏有關，該酶在醫學研究中被廣泛研究。另一種硫醇雙加氧酶是真核生物半胱胺雙加氧酶，催化半胱胺轉化為亞牛磺酸。迄今為止，還鑒定和表征了幾種真細菌的Cdo同源物。V.paradoxus TBEA6、Advenella mimigardefordensis DPN7T、Pseudomonas aeruginosa和Ralstonia eutropha H16的Cdo同源物被研究并表征為3-巰基丙酸雙加氧酶（Mdo）。雖然V.paradoxus TBEA6和A.mimigardefordensis DPN7T的Mdo僅對3-巰基丙酸有活性，將其轉化為3-亞磺基丙酸，但P.aeruginosa和R.eutropha H16的Mdo還利用半胱氨酸作為底物，盡管速率顯著較低。

圖2顯示了硫醇雙加氧酶催化的反應概述以及Msdo預測結構與P.aeruginosa Mdo公開晶體結構的結構比對。

哺乳動物和細菌Cdo及Cdo同源物的晶體結構揭示了幾種高度保守的氨基酸殘基。例如，金屬離子輔因子由三個保守組氨酸殘基（3-His面部三聯體）配位。在真核生物Cdo中存在半胱氨酸-酪氨酸交聯，這增加了酶活性但不存在于細菌Cdo中。由哺乳動物Cdo的氨基酸殘基R60、Y58、H155和Y157形成氫鍵網絡，這對半胱氨酸羧基在活性位點口袋中的定位至關重要。多重序列比對顯示這些殘基也存在于Msdo中：R66對應哺乳動物Cdo的R60，Y58在Msdo中被Q64取代，H163對應H155，Y165是對應人類Cdo Y157的殘基。

為了獲得對V.paradoxus B4新型硫醇雙加氧酶活性位點結構的更深入了解，通過定點誘變生成酶變體并針對催化活性進行表征。因此，參與鐵配位的三個組氨酸殘基中的兩個各被亮氨酸取代，產生酶變體MsdoH93L、MsdoH95L。可能參與氫鍵網絡的組氨酸也被亮氨酸殘基取代，產生變體MsdoH163L。此外，還生成了攜帶可能參與酶活性或結構完整性的其他氨基酸殘基取代的變體：MsdoQ64A、MsdoR66A、MsdoC100S和MsdoY165F。

2.材料與方法

2.1.細菌菌株和生長條件

本研究中使用的細菌菌株、質粒和寡核苷酸（引物）列于表1。對于大腸桿菌菌株的培養，細菌在液體或固體LB培養基中培養，含有氨芐青霉素（75μg/ml），對于攜帶pLysS的菌株，額外添加氯霉素（34μg/ml）。

2.2.巰基琥珀酸雙加氧酶的定向誘變

對于巰基琥珀酸雙加氧酶的定向誘變，使用先前研究中生成的表達載體pET23a(+)::msdoB4作為PCR模板DNA。每種情況下，通過點突變將一個編碼特定氨基酸的靶DNA三聯體替換為替代三聯體，例如位置93的組氨酸被亮氨酸取代產生MsdoH93L。生成以下酶變體：MsdoQ64A、MsdoR66A、MsdoH93L、MsdoH95L、MsdoC100S、MsdoH163L和MsdoY165F。使用Phusion DNA聚合酶和補充有1%(v/v)DMSO的Phusion High Fidelity緩沖液進行PCR擴增。對于msdo的定點誘變以生成變體MsdoH93L、MsdoH95L、MsdoH163L和MsdoY165F，使用一個磷酸化引物和一個非磷酸化引物進行擴增。在98°C初始變性2分鐘后，樣品進行30個循環的98°C變性20秒、60°C退火20秒和72°C延伸2.5分鐘，最后在72°C延伸5分鐘。對于其他變體的構建，使用非磷酸化引物。對每個變體進行梯度PCR（每個溫度一個反應管）。為此，樣品在98°C初始變性30秒，然后進行18個循環的98°C變性30秒、55-65°C退火1分鐘和72°C延伸5分鐘，最后在72°C延伸10分鐘。PCR后，將不同溫度的十個反應管合并，樣品在37°C下用FastDigest DpnI處理15分鐘以去除甲基化模板DNA。所有獲得的PCR產物使用peqGOLD凝膠提取試劑盒按照制造商說明從瓊脂糖凝膠中純化。使用T4 DNA連接酶進行連接。然后將獲得的質粒用于轉化CaCl2-感受態大腸桿菌Top10細胞。通過質粒DNA測序鑒定攜帶所需突變的正向克隆，測序由Seqlab進行。然后用驗證的質粒轉化表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)pLysS的CaCl2-感受態細胞。