4討論

與單個細胞相比，間充質干細胞球表現出更高的細胞存活率和營養因子分泌量，使其成為細胞療法中一種很有前景的移植選擇。然而，對于間充質干細胞球體是否含有缺氧核心，以及缺氧核心是否直接導致了間充質干細胞球體的這些增強特性，文獻中還存在分歧。在這些研究中，我們確定間充質干細胞球體內的氧梯度與體外氧分壓相差不到10%。隨著間充質干細胞球體大小的增加，球體內的堆積密度降低，從而促進了氧氣和營養物質的運輸。盡管如此，我們發現葡萄糖的消耗隨著球體尺寸的增大而發生了明顯變化。這些數據表明間充質干細胞球體功能隨球體大小而變化，但間充質干細胞球體功能的增強并不是由于球體核心缺氧所致。

假定間充質干細胞球體內存在缺氧核心主要是基于有報告顯示癌細胞形成的球體內存在缺氧和壞死核心，以及最近肝細胞球體內存在缺氧核心。我們無法將這些發現應用于間葉干細胞，因為癌細胞和肝細胞都存在于高氧的龕位中，而間葉干細胞通常存在于生理氧分壓低得多的龕位中。因此，不同類型細胞能夠誘導壞死的氧分壓可能不同。此外，間充質干細胞球形體的應用與癌癥球形體有很大不同，因為球形體的形成會促使間充質干細胞分泌更多的營養因子，而癌癥球形體則被用作體外腫瘤模型。由于缺氧性腫瘤具有抗輻射的特性，癌癥球形體被設計成以壞死為核心，周圍為缺氧區，以有效研究治療策略。雖然我們在用60000個或更少的間充質干細胞形成的球體內沒有檢測到缺氧核心，但其他報道稱間充質干細胞球體內的缺氧誘導因子(HIF-1a)趨于穩定，這代表了改善細胞存活和生長因子分泌的潛在途徑。不過，這種說法是基于對直徑小于200μm的間充質干細胞球體進行免疫熒光染色，而且染色只發生在球體外圍，更可能是聚集應力而非氧分壓梯度的結果。其他研究人員通過對球體橫截面進行組織學分析來研究缺氧核心的存在，結果表明直徑達1000μm的球體內存在增殖細胞。據我們所知，這是第一項直接測量間充質干細胞球體內氧分壓空間分布的研究，即使是由60000個間充質干細胞形成的最大球體，其中心也沒有接近缺氧狀態。事實上，我們在制作含有至少25萬個間充質干細胞的球體時才發現缺氧核心的形成。缺氧并沒有氧分壓的嚴格定義，它取決于細胞類型和生理條件。我們將缺氧定義為允許細胞存活和發揮功能的臨界氧分壓。我們在實驗和數值上只觀察到氧分壓的微小變化，不足以通過組織學分析引起細胞窘迫的跡象，這表明在這些球體內沒有發生缺氧信號傳導。然而，由于設備的限制，這些研究是在環境空氣中進行的，在氧氣和營養物質較少的體內，誘導梯度可能會變得更加顯著。盡管如此，這并不會降低這些研究結果的影響，因為間充質干細胞球體在環境條件下分泌營養因子增加的情況此前已有報道。

隨著每個球形體細胞數量的增加，堆積密度降低，形成了緊密堆積的較小球形體和松散堆積的較大球形體。這可能就是為什么氧分壓在較大的球體內沒有顯著降低的原因，因為較大的細胞間空間允許氧氣和營養物質向球體中心運輸。對特定癌系球形體的研究未能證明球形體大小與堆積密度之間存在這種相關性。雖然間充質干細胞球體內的細胞活力和肌動蛋白介導的收縮力呈正相關，但這種適應性堆積密度以前從未報道過。然而，由于分化狀態和動態培養條件的不同，間充質干細胞球體形態也存在差異，這兩者都可能影響整個球體的氧擴散。氧擴散率的增加也反映在K/D值上，因為較小的緊密包裹球體(每個球體含有15000個細胞)的K/D值是60000個細胞球體的兩倍多。有趣的是，雖然氧梯度并不嚴重，但增加每個球形體細胞的數量會顯著增加Caspase的活性并降低代謝活性。這與我們之前的研究結果一致，我們發現較小的球體具有更強的代謝活性和增殖能力。其他研究報告稱，改變每個球形體的細胞數對每個細胞的三磷酸腺苷(ATP)水平沒有影響；不過，這些研究是在每個球形體有500到5000個細胞的情況下進行的，這些球形體可能還不夠大，不足以引起代謝活性的變化。

許多研究都報道了間充質干細胞球體內Caspase活性增加的現象，并推測這種現象是由于聚集應力造成的。在這些研究中，我們觀察到較大的球體中Caspase水平升高，但沒有缺氧核心，而且它們表現出堆積密度降低，這可能是由于聚集應力降低所致。在這些球體內沒有檢測到凋亡的早期和中期標志物AnnexinV。因此，細胞凋亡似乎既不是氧分壓的功能，也不是聚集應力的功能，這表明三維聚集體中有一個獨立的中介，值得進一步研究。

我們觀察到葡萄糖消耗量隨著球形體大小的增加而減少，細胞內葡萄糖和6-磷酸葡萄糖也減少了，但我們通過乳酸-葡萄糖比值發現葡萄糖代謝沒有變化。葡萄糖消耗減少但乳酸-葡萄糖比值保持不變，這表明葡萄糖攝取受損是球形體大小的一個功能。球粒直徑是否會調節葡萄糖轉運體的表達和/或活性，或許是通過AMP激酶(其活化受葡萄糖生物利用率的調節)，這是個引人入勝的可能性。之前對二維粘附間充質干細胞的研究結果顯示，不同物種的代謝特征各不相同。同樣，一個物種中來自不同供體的間充質干細胞表現出不同的乳酸-葡萄糖比率，這表明了代謝的異質性。相比之下，我們發現球形間充質干細胞的乳酸-葡萄糖比率與球形大小或供體無關。間充質干細胞球體處理葡萄糖和6-磷酸葡萄糖的代謝途徑仍有待明確。乳酸-葡萄糖比率隨著每個球形細胞數量的增加而降低，這表明葡萄糖通過三羧酸(TCA)循環被完全氧化成二氧化碳。另外，葡萄糖也可轉入合成代謝途徑(磷酸戊糖途徑產生用于還原生物合成的NADPH或形成用于核苷酸合成的核糖-5-磷酸)。雖然目前還沒有其他研究對間葉干細胞球體的生物能進行研究，但劉等人的研究發現，播種密度會影響細胞的新陳代謝。與高密度培養的細胞相比，低密度培養的間充質干細胞依賴有氧糖酵解產生ATP，糖酵解與TCA循環的耦合減少，磷酸戊糖途徑的活性增強。這些結果是否能轉化為球形細胞內的三維培養還需要進一步研究，但這些數據表明，不同大小的球形細胞在減少移植到低氧微環境中形成的活性氧方面可能具有不同的能力。

隨著球形體體積增大，葡萄糖攝取量和細胞存活率降低，其中一個可能的機制是蛋白質含量減少導致可用的整合素結合位點減少。雖然確切的機制還有待闡明，但球體形成的簡化模型涉及細胞-細胞接觸、粘附蛋白積累、ECM沉積、整合素結合和球體壓實。然而，由于間充質干細胞球體會調整其堆積密度，以便于氧氣和營養物質的運輸，這就犧牲了ECM的沉積和細胞粘附的整合素位點。細胞基質能增強細胞的存活和功能，而間葉干細胞球體的形成能促進層粘連蛋白、彈性蛋白、1型膠原和纖連蛋白等ECM蛋白的生成。此外，我們最近證實，間充質干細胞球體(每個球體含有15000個細胞)可沉積富含膠原蛋白的ECM，而間充質干細胞的整合素與ECM的相互作用可驅動細胞的命運。因此，球體形成增強間充質干細胞功能的能力至少部分是由細胞-ECM相互作用介導的，而這些細胞-ECM相互作用隨著球體大小的增加而減少。這反過來又可能導致細胞新陳代謝下降和細胞凋亡增加。

總之，由多達6萬個間充質干細胞組成的球體不會出現缺氧核心，這一發現增加了其臨床轉化的潛力。形成大型、可存活的組織構建體的能力是組織工程領域面臨的一項重大挑戰。由于間充質干細胞球體能適應其堆積密度，因此不會出現壞死，它們是新興的生物打印領域前景廣闊的構建模塊。間充質干細胞與其他多種細胞類型形成共生關系，可應用于各種不同的組織。