3結果

3.1間充質干細胞球體內氧氣分布的數值模擬

圖1(d)測量的氧分壓值與球面距離的函數關系。(e)利用測得的氧分壓值，通過公式(2.5)從每個球面尺寸的平均數據生成數學模型，并與球面內各點的平均氧分壓值一起繪制。(f)根據測得的氧分壓值計算每個球面的K/D。(g)通過將數學模型映射到適當直徑的球體橫截面上，在三維空間中顯示氧分壓與半徑的函數關系?？潭染€代表250μm。

對不同大小的球體每隔10μm測量一次氧分壓(圖1d)。培養基中氧分壓的實驗測量值為267μM O2，不同大小的球體中氧分壓保持不變。在分析之前，將球體從懸掛的液滴轉移到顯微載玻片上。15000細胞球體和30000細胞球體之間的氧分壓梯度沒有明顯差異，而60000細胞球體的氧分壓下降速度幾乎是15000細胞球體和30000細胞球體的兩倍。數據歸一化為非尺寸單位r/R，根據這些實驗數據，利用公式(2.5)為每個球面生成數學模型(圖1e)。計算出每個球面的α、β和γ值，然后用來計算b和K/D。對于所有三種大小的球面，我們確定γ全等于0，表明b=0。在這些研究中，我們將缺氧定義為允許細胞存活和發揮作用的臨界氧分壓。如果細胞不再具有活力，那么它們就無法消耗氧氣和營養物質，因此b值代表了缺氧核心的邊界，在這個邊界上，dC/dr=0。因此，由于這些間充質干細胞球體的b=0，這些研究結果表明這些球體內不存在缺氧核心。

雖然球體內明顯存在梯度，而且隨著球體尺寸的增大，梯度也會隨之增大，但在每個含有60000個細胞的最大球體內，外層細胞與內核之間的氧分壓下降不到10%。無論球體直徑大小如何，氧分壓值在中心點之前都沒有接近dC/dr=0的點，這表明這些球體沒有表現出氧氣傳質的限制。然后利用數學模型中的a和b系數計算每個球體的K/D。與其他兩種尺寸的球體相比，最小的球體(每個球體有15000個細胞)的K/D值有所增加，這表明如果假定不同直徑的球體內氧氣消耗的反應速率不變，則擴散系數較小(圖1f)。利用方程(2.4)對各點的K/D進行數值求解，驗證了這一假設(數據未顯示)。為使三維氧梯度可視化，將數值數據映射到球體中平面的橫截面上，改變球體直徑，使其與每種尺寸的球體平均直徑一致(圖1g)。

3.2堆積密度隨球面尺寸增大而降低

圖2球粒堆積密度隨著球粒尺寸的增大而減小。(a)計算了假設最大堆積密度的預測球面半徑，并與測量的球面半徑一起報告。(b)隨著球面尺寸的增大，堆積密度明顯降低。(c)DNA含量隨每個球形體細胞數的增加而線性增加。(d)歸一化蛋白質含量隨著球形體大小的增加而減少。(e)H&E染色顯示，15000細胞球體(i)比較大的30000細胞球體(ii)和60000細胞球體(iii)更緊湊。標尺條代表250μm。

我們注意到，測得的半徑與每個球形體的細胞數并不呈立方關系。為了直觀地說明這一點，我們使用公式(2.6)計算了假設最大堆積密度的預測球形半徑，并將其與測量半徑繪制成圖(圖2a)。較小球體(每個球體15000個細胞)的測量半徑與預測半徑相關性良好，但30000個和60000個細胞球體的測量半徑分別比相應的預測半徑大16%和25%。從這些數據可以看出，間充質干細胞球體的堆積密度一定會隨著球體大小的增加而降低，從而使氧氣和營養物質更容易滲透到球體中心。因此，我們使用公式(2.7)計算了堆積密度，并證實隨著每個球形細胞數量的增加，細胞在球體內的堆積密度明顯降低(圖2b)。為了驗證球體直徑的差異是由于堆積密度而非細胞增殖造成的，我們對DNA含量進行了量化，作為每個球體內細胞數量的指標。DNA含量與每個球體內的細胞數量相關(R2=0.964)，證實每個液滴中的所有間充質干細胞都融入了球體內，在球體形成過程中細胞數量沒有增加(圖2c)。每個細胞的蛋白質含量隨著堆積密度的降低而減少(圖2d)，這表明在較大的球體內ECM含量相對減少。使用血紅素和伊紅(H&E)可進一步觀察細胞的堆積密度和ECM含量，隨著球體尺寸的增大，整個球體結構中的許多空腔變得更加明顯。H&E染色還顯示，在所有三種尺寸的球形體中，外層細胞看起來比內部細胞更密集，更細長，而且隨著直徑的增加，球形體的球形度普遍降低(圖2e)。

3.3細胞活力和新陳代謝活性隨著球形體大小的增加而降低

圖3細胞存活和葡萄糖消耗受球形大小的影響。(a)間充質干細胞球體內Caspase 3/7酶活性，(b)葡萄糖總消耗量，(c)L-乳酸總產生量。

與較小的15000個和30000個細胞的球形體相比，最大的球形體(每個球形體有60000個細胞)顯示出更高的Caspase活性，表明細胞凋亡(圖3a)。通過測量葡萄糖消耗量和乳酸鹽產生量，研究了球形細胞的有氧狀態?？偲咸烟窍牧侩S著球體大小的增加而明顯減少，15000細胞球體的葡萄糖消耗量比較大的60000細胞球體高出約四倍(圖3b)。細胞內葡萄糖和6-磷酸葡萄糖水平的測量結果表明，較大的球體消耗的葡萄糖比較小的球體少。細胞內葡萄糖測量的是瞬時水平，而不是兩天內的葡萄糖總消耗量，因此與葡萄糖總消耗量相比有數量級的減少。L型乳酸鹽的總產生量與葡萄糖消耗量的趨勢相同(圖3c)。由于α-MEM中不存在L-乳酸，所有L-乳酸都是細胞代謝的結果。無論球形體大小如何，所有組從葡萄糖中產生的乳酸產量相似。

3.4細胞存活率和缺氧的組織學檢測

圖4細胞存活率的組織學分析表明，不同直徑的球體之間沒有明顯差異。(a)活細胞(綠色)/死細胞(紅色)染色顯示，15000個、30000個和60000個細胞球體內的間充質干細胞存活率相同。一個60000細胞球體在甲醇中孵育，作為碘化丙啶的陽性對照(最右邊)。(b)Annexin V(紅色)和DAPI(藍色)染色進一步驗證了沒有細胞凋亡，因為15000、30000和60000細胞球體的球心和外圍都沒有陽性染色。500000個細胞球體作為附件素V的陽性對照。標尺條代表500μm；圖像使用20×物鏡拍攝。(c)細胞凋亡指數的量化，以核心相對于外圍的附件素V陽性染色面積計算。

使用活/死染料觀察球體內的細胞活力，結果顯示不同大小的球體之間沒有明顯差異。將較大球體內沒有死細胞的情況與陽性對照進行比較后進一步得到了驗證，陽性對照是將每個球體內含有60000個細胞的球體放入70%甲醇中培養，以便在使用活體/死體染料培養前殺死細胞(圖4a)。從這些圖像中可以看出，每個球體內的細胞都是活的。甲醇溶液導致陽性對照組的球形細胞收縮，形成長圓形。附件素V染色進一步證實，15000、30000和60000個細胞的球形核心內沒有凋亡細胞(圖4b、c)。這些結果與我們量化Caspase3/7蛋白酶活性的數據略有不同，后者表明細胞正在積極凋亡。Caspase活性的靈敏度很高，而且是以相對發光的形式測量的，因此它更有價值用于比較樣本內的情況，而不是斷定是否存在細胞凋亡，因為所有細胞群都有一個凋亡活性基線。

圖5缺氧組織學分析表明，不同直徑的球體之間沒有明顯差異。Pimonidazole(綠色)和DAPI(藍色)染色進一步驗證了15000、30000和60000細胞球體內沒有缺氧核心。一個60000細胞球體在1%氧氣中培養5天，作為皮尼達唑染色的陽性對照(右圖)?？潭染€代表500μm；圖像使用20×物鏡拍攝。

免疫組化染色進一步驗證了我們的氧分壓測量結果，并驗證了缺氧核心的存在，因為任何球體內都沒有皮尼達唑染色(圖5)。Pimonidazole對低于14μM O2的區域進行熒光標記，常用于癌細胞球和肝細胞球，以劃分缺氧核心的邊界。因此，沒有熒光信號表明這些球體內不存在缺氧核心。陽性對照組(每個球形體有60,000個細胞，收集前在1%氧氣中培養5天)產生的球形體更松散、更小，這可能是由于培養基沒有更新，細胞死亡程度高所致。

為了確定直徑更大的球形體是否會在其核心部位出現明顯的細胞凋亡和缺氧，我們分別形成了100000、250000和500000個細胞的球形體，并對其進行了附件素V和波尼噠唑染色。與本文報告的15000、30000和60000個細胞球體的結果不同，從每個球體250000個細胞的大小開始，就觀察到了統計意義上顯著的缺氧核心(補充材料，圖S2)，這與核心中顯著的附件素V信號相關。這些結果表明，間充質干細胞球體內確實存在缺氧核心，并與細胞凋亡增加有關，但只有在比本文研究的細胞體積大得多的情況下才會出現。