與離體間充質干細胞相比，間充質干細胞(MSCs)形成的球狀體顯示出更高的細胞存活率和營養因子分泌量，使其在細胞療法方面具有治療優勢。目前，人們對其作用機制尚未達成共識。許多人假設，球體的形成是通過在直徑足夠大的球體內產生一個缺氧核心來增強細胞功能的。本研究的目的是通過測量直徑不斷增大的間充質干細胞球體內的氧分壓，并將氧分壓值與細胞功能相關聯，從而通過實驗確定間充質干細胞球體內是否會產生缺氧核心。每個間充質干細胞球體由15000、30000或60000個細胞組成，半徑分別為176±8μm、251±12μm和353±18μm。氧分壓值和數學模型顯示，在最大的球體內，氧分壓梯度與外徑的變化不到10%。盡管氧分壓的徑向變化不大，但隨著細胞數量和球體大小的增加，球體的細胞代謝顯著下降。這可能是由于隨著球體直徑的增加，基質沉積和堆積密度適應性降低，從而使球體避免形成缺氧核心?？傊?，這些數據提供了間充質干細胞球體功能增強并非由氧氣介導的證據。

1引言

間充質干細胞(MSCs)是目前廣泛研究的再生療法。然而，要將間充質干細胞療法轉化為臨床實踐，面臨的一大挑戰是確保間充質干細胞移植到缺損部位后的存活率和功能。先前的研究報告指出，缺血情況下細胞的高死亡率和低接合率降低了干細胞療法的療效，因為只有不到1%的間充質干細胞在移植到缺血缺損部位4天后存活。出現這些并發癥的可能原因包括移植到缺氧和炎癥環境中，以及從培養皿中收獲擴增細胞時常用的蛋白水解酶處理導致培養過程中產生的細胞外基質(ECM)丟失。

我們和其他人已經證明，間充質干細胞形成三維球體后，整體功能增強，存活率提高。與同等數量的離體間充質干細胞相比，15000個細胞的間充質干細胞球體表現出相似的Caspase3/7蛋白酶活性，但分泌的血管內皮生長因子卻高達100倍。用更多間葉干細胞形成的較大球體，其Caspase活性增加，代謝活性和增殖減少。由于營養物質運輸的擴散長度受到限制，因此必須仔細考慮球體的大小，這一特點可能會使半徑大于200μm的球體核心細胞容易缺氧和死亡。有人推測，球體內缺氧核心的存在可能會對細胞進行預編程，以促進細胞存活并增強其營養因子的分泌。因此，使用半徑接近營養運輸限制的球體可能會帶來額外的優勢，但如果半徑超過營養運輸限制則不會。然而，對于這種缺氧核心是否存在或是否是增強間充質干細胞球體功能的必要條件，文獻中還存在分歧。

以前使用癌細胞和肝細胞進行的研究使用了氧微電極來測量它們的穩態氧值，而其他研究則生成了預測性數學模型，但無法直接測量氧分壓值來驗證模型。雖然已有大量建模研究致力于研究球體內的運輸現象，但之前的研究是針對以不同速度消耗氧氣和營養物質的非多介質細胞群體進行的。此外，間充質干細胞形成球狀體的意義與癌細胞和肝細胞大不相同，因為間充質干細胞在體內不會自然形成球狀體，而是作為一種工具，使細胞能夠最大限度地分泌營養因子。最后，不同類型細胞的堆積密度和孔隙率不同，導致擴散速度也不同。

本研究的目的是評估間充質干細胞球體內的氧分壓曲線，以確定是否存在缺氧核心，進而將細胞存活與這些聚集體中的氧供應相關聯。我們使用氧微電極測量直徑不斷增大的球體內氧分壓與半徑的函數關系。數據被用于使用數學模型對球體內的氧梯度進行數值描述。我們測量了細胞活力和新陳代謝與球體大小的函數關系。最后，我們測量了球體直徑和堆積密度，以研究細胞在較大球體內存活的潛在途徑。這些研究結果加深了我們對球體大小、營養物質運輸和細胞功能之間相互作用的理解。

2材料與方法

2.1細胞培養

使用來自兩名供體的人骨髓間充質干細胞，無需進行其他表征。間充質干細胞在標準培養條件(37℃、21%O2、5%CO2)下，在添加了10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的最小必需培養基-α修飾(α-MEM)中擴增，直到第4-5代。

2.2球體的形成和表征

使用懸滴技術在48小時內形成間充質干細胞球體，每25μm液滴含15000、30000或60000個細胞。之所以選擇這個范圍，是因為之前有報道稱，形成的球體大小低于或高于氧氣的擴散極限，營養因子分泌增加，同時也是為了研究文獻中報道的類似大小的球體。之所以選擇這種形成持續時間，是因為它能夠持續形成緊密的球體。球體聚集48小時后，通過明視野顯微鏡對球體直徑進行量化，并使用IMAGEJ進行分析。

2.3氧分壓測量

圖1(a)氧氣微電極和間充質干細胞球體的實驗裝置。

在25℃的環境空氣中，使用Unisense氧氣微電極OX-10(Unisense，丹麥)測量球體內的氧分壓，該電極的外端直徑為10μm，檢測限為0.3μM O2。用玻璃微量移液管在微弱的吸力下固定球形體，使用Eclipse TS100顯微鏡觀察微電極的放置情況。使用焦平面將微電極置于球體中部，每隔10μm測量一次氧分壓，直至球體中心。為了避免微電極與玻璃微量移液器接觸，沒有對球面的整個直徑進行剖面測量(圖1a)。

2.4數學建模

在對相應位置的氧分壓進行采樣后，這些數據被用于生成數學模型。由于球體內的間充質干細胞在向中心擴散的過程中會消耗氧氣，因此我們將這些數據與之前描述的同時消耗氧氣的擴散運輸質量轉移方程進行了擬合：

(2.1)

其中，C為氧氣濃度；t為時間；D為二元擴散系數；ψ為反應項，假設如下：

(i)系統處于穩定狀態。

(ii)氧的變化只發生在一個維度上，即徑向坐標r，而不取決于極角(θ)或方位角(w)。

(iii)氧氣消耗的反應速率是零階反應；細胞消耗氧氣的最大速率K在每個球體內都是恒定的。

該方程可以用球面拉普拉卡矩改寫為

(2.2)

r是徑向坐標。

微分方程可以寫成

(2.3)

可行的解決方案是

(2.4)

其中，R是球面半徑；C0是球面的氧氣濃度；b是dC/dr=0時的半徑，代表球面內缺氧核心的邊界(圖1b、c)。

圖1(b)低氧核心存在/不存在的示意圖；(c)理論示意圖，說明缺氧核心的存在/不存在對氧分壓曲線的影響。

這可以進一步簡化為

(2.5)

為了求解K/D[=]mol/(L*cm2)和b[=]μm的值，將氧氣濃度和球體內相應的徑向位置輸入方程(2.5)，并在MATLAB中進行數值積分。

2.5球體尺寸和堆積密度分析

為了估算球體半徑，假定細胞組裝成球體時遵循均勻硬球緊密堆積的行為。類似大小的硬球陣列可達到的最大體積分數為π/全等于0:74，球體內間充質干細胞的直徑估計為15μm，因此每個間充質干細胞的體積為1767μm3。

預測球面半徑

(2.6)

堆積密度是用已知細胞數除以集合體體積計算得出的，假定為球形。

(2.7)

2.6評估細胞功能

球形形成后，用被動裂解緩沖液裂解間充質干細胞，使用Caspase-Glo 3/7分析法對每個樣本的100μl裂解液進行凋亡定量測定。熒光在微孔板閱讀器上檢測，并與DNA含量歸一化，DNA含量是使用Quant-iTPicoGreen DNA檢測試劑盒從相同裂解液中測定的。根據生產商的說明，使用雙喹啉酸測定法測定蛋白質濃度，并與DNA含量標準化。葡萄糖和乳酸的濃度由培養基樣本和裂解緩沖液測定，并根據生產商的說明使用比色測定試劑盒進行評估。葡萄糖消耗量的計算方法是，從生產商提供的5.5mM初始儲備培養基中減去剩余的葡萄糖濃度。由于α-MEM中不存在乳酸鹽，因此培養基中測得的所有乳酸鹽都是作為細胞呼吸的產物計算的。6-磷酸葡萄糖(G6P)是根據生產商的說明，使用市售的酶測定法對裂解液進行評估，并與細胞數量進行歸一化。

2.7組織學分析

間充質干細胞球體的細胞活力是通過活-死檢測法評估的，該檢測法基于鈣黃綠素AM和碘化丙啶同時測定活細胞和死細胞。作為碘化丙啶的陽性對照，在用鈣藍蛋白AM/碘化丙啶溶液孵育30分鐘之前，按照生產商的說明將每個球形體含有60000個細胞的球形體放入70%的甲醇中孵育。為了觀察球體內細胞凋亡早期至中期階段的凋亡區域，在由10mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸、140mM氯化鈉和2.5mM氯化鈣組成的緩沖液中，將與異硫氰酸熒光素(FITC)共軛的附件素V以1:20的稀釋度涂抹在切片上。在清洗和成像之前，樣品在37℃溫度下與附件素V一起孵育30分鐘。通過胰藍排除法確定的存活細胞作為附件素V染色的陰性對照，而在750nM石杉堿中孵育20小時的細胞以及500000個細胞球作為陽性對照。所有樣本均使用40,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色。將FITC信號(annexinV)面積與藍色信號(細胞核)面積進行歸一化處理，以確定每個球形體內部和外圍區域的凋亡指數，從而顯示球形體內部是否存在凋亡核心。

為了觀察球體內的缺氧區域，在球體內加入鹽酸咪唑(200mM)并在環境空氣中培養2小時。作為陽性對照，收集前將每個球形體含有60000個細胞的球形體在1%的氧氣中培養5天，在此過程中也在1%的氧氣中與咪唑一起培養。用試劑盒中1:50稀釋的小鼠單克隆抗匹莫尼噠唑IgG對細胞進行初級檢測，并用DAPI對細胞進行反染。

使用EclipseTE2000U顯微鏡和Andor Zyla數碼相機對球形體進行成像。收集球狀物并用10%福爾馬林固定，用磷酸鹽緩沖生理鹽水清洗，然后包埋在HistoGel中。用Tissue-TekOCT化合物包埋樣本，在CM1850型低溫恒溫器上切割10μm的切片，然后裝入顯微鏡載玻片進行分析。為觀察細胞形態，按上述方法收集球體并進行冷凍切片，但收集前不進行染色。然后用H&E染色切片并成像。