藥物積累和分布研究

圖4、用(A)化合物1、(B)化合物2和(C)飽和鉑處理缺氧HT1080球體內的鉑分布。使用20毫米薄的冷凍切片進行ICP-MS測量。

藥物吸收和滲透不良被認為是不同化合物在球狀模型中活性降低的因素。為了闡明所研究的鉑復合物的藥物滲透性與不同細胞毒性之間的關系，我們利用LA-ICP-MS對1、2和飽和鉑在缺氧HT1080球體內的鉑分布情況進行了研究。所有化合物在缺氧HT1080小球中的穿透性相當，鉑在壞死球核中有聚集熱點(圖4A-C)，這表明鉑復合物對缺氧區域有很高的親和力，并強調了對這些區域可能產生的靶向效應。此外，我們還清楚地表明，藥物滲透性并不是鉑(IV)復合物在HT1080球形模型中細胞毒性差異的原因。

表3、用1-4處理的缺氧球狀模型中的鉑積累與化合物的還原率和親脂性有關。

此外，缺氧球形體的藥物總積累數據顯示，與其他鉑化合物相比，3號化合物被所有三種細胞系吸收的效果更好(表3)。這一發現與細胞毒性數據(表1)相關，因為化合物3在球形細胞和單層培養中的IC50值最低。一般來說，鉑的積累量與化合物的親脂性完全相關，因為親脂性的順序與積累量增加的順序相當，3(最親脂性)>2>1(最不親脂性)(表3)。然而，親脂性和蓄積性都與缺氧球體內的活化作用不一致。雖然化合物1在缺氧的CH1/PA-1球形體內顯示出7倍的活化作用，化合物2顯示出2倍的活化作用，但化合物1的累積效果不如化合物2。尤其是積累量最高的化合物3在缺氧CH1/PA-1球形體內的活性與化合物1相當。

總體而言，在所有研究細胞系的缺氧球形體中進行的積累研究顯示了以下積累順序：3>2>4>1。在缺氧的HT1080(3>2/4>1)、HCT116(3>2>4/1)和CH1/PA-1(3/1>2/4)球形細胞中獲得的IC50值一般與蓄積順序一致，化合物3的細胞毒性最強。然而，與單層培養相比，缺氧球形體中的活化順序與積累數據沒有相關性。低氧球形培養物(HT1080(1>2/4>3)；HCT116(1>4>2>3)；CH1/PA-1(1>4>2/3))中的活化順序更強調了積累量最高的化合物3在低氧條件下的活化程度最低，而積累量最低的化合物1在低氧條件下的活化程度最高。這些結果表明，缺氧條件下的活性并不高度依賴于藥物的積累和親脂性，而似乎依賴于所應用的鉑(IV)化合物的還原速度。

動物研究

圖5、(A)等摩爾劑量的1號、2號和沙鉑在雄性SCID小鼠皮下人類HT1080細胞腫瘤的體內活性(n=4，在第4、7、11、14天(黑色箭頭所示)進行治療)。(B)第15天，所有治療組的腫瘤重量與陰性對照組相比，與對照組有顯著差異。在陰性對照組和沙鉑組中，由于分別有一只動物在第13天和第14天出現腫瘤潰瘍，因此只能確定3只動物的腫瘤重量。(C)所有治療組的體重。(D)在第15天收集的小鼠組織、血球和腫瘤中，用ICP-MS測定1、2和沙鉑的鉑濃度(平均值)。

1、2和沙拉鉑(作為參比化合物)在SCID小鼠的人異種移植中進行了進一步研究。由于兩種化合物在缺氧球形模型中的IC50值均有所降低或相當，且在小鼠模型中具有良好的適用性，因此敏感性較低的HT1080細胞系被選為最適合進行異種移植實驗的細胞系。在第4、7、11和14天以等摩爾劑量給藥(化合物1為8.3毫克，化合物2為9.1毫克，沙鉑為10毫克)。沙鉑僅引起短暫的生長延遲，在第11和12天腫瘤負荷減少(圖5A)。然而，隨后腫瘤又重新生長，導致第15天時腫瘤負荷與對照組動物幾乎沒有差異。關于我們的新型鉑(IV)藥物，還原性較慢的復合物1沒有顯示出任何抗癌活性。相比之下，最易還原物質2從第11天起就能顯著減少腫瘤生長(圖5A)，并在第15天顯著減少腫瘤負荷(圖5B)。這也反映在體重上，因為HT1080細胞腫瘤的快速生長與體重的緩慢下降有關，而在腫瘤負荷減少的2處理動物中卻觀察不到這種情況(圖5C)。

將體內活性的順序(1<沙鉑<2)與物質的理化性質進行比較，可以看出與親脂性沒有關系，而還原率的作用似乎是一致的，中間還原率對體內活性非常有利。此外，腫瘤組織中的鉑含量并不是唯一的決定性因素，因為2的蓄積程度并不是最高的，而是介于1和沙鉑之間(圖5C)。所有化合物都會在腎臟中蓄積，這表明會從腎臟排出，但值得注意的是，親脂性最低的化合物1在肝臟中的蓄積量最高。在血流中發現2的鉑濃度增加，表明與1和沙鉑相比，它在循環系統中的滯留率更高。

用LA-ICP-MS分析鉑在腫瘤切片中的分布情況

與利用ICP-MS測量組織中的平均鉑濃度相比，利用LA-ICP-MS進行生物成像在評估鉑在組織學異質結構中的分布方面具有優勢。用化合物1、2或沙鉑等摩爾處理SCID小鼠的HT1080腫瘤后，制備了LA-ICP-MS測量方法，以確定鉑在顯微鏡下的積累情況。鉑金的分布與組織學(通過連續切片的H&E染色觀察)以及共聚焦顯微鏡下通過比莫尼噠唑染色共同定位的缺氧區域相關。由于皮莫尼唑染色需要固定步驟，因此無法同時檢測壞死區域。

總的來說，使用相應的鉑化合物處理后，在消融的腫瘤切片中觀察到鉑的不均勻分布。鉑富集區(用紅色表示)很可能與小鼠的血管(微血管)(圖6B和E)、疏松的軟組織(僅有少量腫瘤細胞浸潤)以及橫紋肌(圖6C-E)相對應。相比之下，由更密集的腫瘤細胞組成的惡性組織的鉑含量通常較低。這些結果與之前對攜帶CT26結腸癌的小鼠腫瘤中的鉑復合物進行的LA-ICP-MS研究結果一致。

具體而言，在使用化合物1(圖6A)和薩克拉鉑(圖6F)治療后的腫瘤切片中，觀察到鉑富集和缺氧區域的相關性。使用化合物2治療后的消融腫瘤樣本顯示存在腫瘤結節(由底層組織學證實)。同樣，腫瘤結節周圍的疏松軟組織區域的鉑含量也有所增加(圖6D)。不過，鉑金也高度集中在腫瘤結節中，組織學顯示該處存在中心壞死區。有趣的是，波尼噠唑在這里與中央壞死區周圍的鉑富集邊緣共定位。這些結果與HT1080球形體的激光消融數據一致，核心中的鉑含量增加，并揭示了鉑物種在體外和體內滲透到這些區域的能力。

總結

缺氧誘導鉑(IV)藥物在實體瘤中的活化是一種有吸引力的靶向抗癌療法策略。因此，研究人員對三種鉑(IV)復合物、其對應的鉑(II)復合物以及作為參考復合物的沙鉑的理化性質與非缺氧和缺氧二維及三維腫瘤細胞培養模型中細胞生物學反應之間的關系進行了研究。隨后，在SCID雄性小鼠模型中進行了體內實驗，為研究結果提供了支持。

雖然親脂性、藥物積累與二維和三維細胞毒性之間存在很強的相關性，但藥物積累的程度與缺氧球體和SCID小鼠模型在缺氧條件下的活化程度幾乎沒有關系。相反，活性似乎取決于這些復合物的還原率，盡管數據表明在三個球形模型中的一個模型中，鉑(II)物種4甚至也有活化作用。還原速率最低的復合物1在所有測試的細胞系和環境中活性最低，而還原速率最快的化合物3的活性似乎在缺氧三維模型中受到過快生物轉化的影響，尤其是在敏感性較低的細胞系中。另一方面，化合物2的親脂性和還原速度居中，似乎具有最佳特性，可產生較高的功效。這種復合物對體內腫瘤生長的抑制作用明顯優于1和沙鉑。據我們所知，與相應的二維模型相比，我們首次在三維CH1/PA-1體外模型中顯示了鉑(IV)復合物的活化作用。這些發現表明，這些鉑(IV)化合物比沙鉑更具優勢。