摘要

糞肥在農業中被廣泛使用，并高度影響了土壤微生物群落，例如氨氧化微生物。然而，關于受糞肥施用影響的稻田土壤中古菌與細菌氨氧化微生物群落的認知仍然很大程度上未知，尤其是長期影響。在本工作中，通過研究兩個復合土壤巖心（長期施用糞肥與未擾動對照），調查了糞肥施用對氨氧化微生物種群、相關潛在硝化速率（PNRs）以及控制該影響的關鍵因素的影響。此外，設計了用NH4+培養5周的土壤實驗以驗證田間研究。結果表明，施用糞肥土壤中細菌amoA基因的拷貝數顯著高于未施用土壤（p<0.05），表明長期糞肥施用對氨氧化細菌（AOB）的種群具有明顯的刺激作用。在施用糞肥的土壤巖心中檢測到的PNRs（14-218 nmol L-1 N g-1 h-1）顯著高于未施用土壤巖心（5-72 nmol L-1 N g-1 h-1；p<0.05）。觀察到PNRs與細菌amoA基因拷貝數而非古菌amoA基因拷貝數高度相關，表明與細菌氨氧化微生物相關的強硝化能力。NH4+-N與AOB的豐度顯著相關（p<0.01）并解釋了96.1%的環境變異，表明NH4+-N是影響AOB種群的主要因素。培養實驗證明，兩種土壤中細菌amoA基因豐度明顯增加（從2.0 x 10^6到8.4 x 10^6 g-1干土重和從1.6 x 10^4到4.8 x 10^5 g-1干土重），而古菌amoA基因則未增加，這與田間觀察結果一致。總之，我們的結果表明，無論是長期還是短期使用，糞肥施用促進了細菌氨氧化微生物的種群規模，而非其古菌對應物，且NH4+-N是關鍵影響因素。

引言

過去幾十年，基于銨的氮肥施用顯著提高了水稻產量。然而，只有27-33%的施用的氮肥能在植物材料中被回收。在農業生態系統中，硝化作用作為耦合的硝化-反硝化作用的第一步，是氮肥損失的關鍵步驟。硝化作用，即NH3轉化為羥胺，由具有關鍵氨單加氧酶（AMO）的氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細菌（AOB）完成。AOA和AOB獨特的生理學和代謝表明，環境因素如pH、有機碳、NH4+可用性和鹽度可能決定這兩個類群在自然生態系統中的分布和功能重要性。基于培養的研究和針對編碼AMO催化亞基A的amoA基因的分子調查已被廣泛用于研究施肥對氨氧化微生物的影響。隸屬于奇古菌門（Thaumarchaeota）內一個新分支的AOA在各種土壤中在數量上超過了其細菌對應物。然而，關于受糞肥施用影響的稻田土壤中古菌與細菌氨氧化微生物群落的認知仍然知之甚少，尤其是長期影響。

在稻田中，化學和有機肥料的強化施用為原位條件下AOA和AOB的生長提供了充足的底物。此外，沿深度在稻田土壤中形成的垂直銨通量/濃度和氧化還原梯度高度影響了微生境中細菌、真菌和古菌（包括AOA）的結構和功能。這些垂直剖面的變化為研究變化的環境對稻田土壤中氨氧化微生物群落的影響提供了一個便利的系統。

本研究旨在調查稻田土壤中AOA和AOB種群的垂直剖面及其對糞肥施用的響應。為實現這些目標，從一個長期施用糞肥的稻田和一個相鄰未施肥且未種植水稻的地點采集了巖心樣本。然后進行了為期5周的培養實驗，以驗證田間研究并調查AOA和AOB響應銨底物添加的動態變化。通過針對amoA基因的定量聚合酶鏈式反應（qPCR）測定了AOA和AOB的豐度。同時測量了土壤性質和PNRs。將土壤化學性質與AOA和AOB豐度之間的關系進行相關性分析，以找出控制其種群大小的關鍵因素以及AOA和AOB在稻田土壤硝化作用中的推定貢獻。

材料與方法

采樣地點與采樣

樣本取自中國南方浙江省嘉興市一個典型水稻種植區的稻田。在一個水稻-小麥輪作系統中，糞肥施用（生長季節的4月至每月兩次）已持續20多年。糞肥主要由牲畜廢物（包括尿液、糞便和沖洗水）構成，這些廢物主要在鄰近農場發酵，并通過兩個渠道輸入稻田。糞肥含有高銨態氮（NH4+-N）和化學需氧量（COD；表1）。其中，銨占全氮（TN）含量的49-60%。選擇一個相鄰未受糞肥影響且未種植水稻的地塊作為對照。土壤樣本于2009年11月收獲后（無水淹條件下）從0-100厘米深度采集。從每個地塊取三個土壤巖心（直徑約5厘米），將同一深度（每10厘米間隔）的樣本混合形成一個復合樣本。樣本在運輸到實驗室時密封在無菌塑料袋中并置于冰上。一部分在4°C儲存用于培養實驗，另一部分通過2.0毫米篩用于土壤特性分析。其余部分在-80°C儲存用于DNA提取和下游分析。

化學性質與潛在硝化速率測量

土壤中的銨、亞硝酸鹽和硝酸鹽用2 M KCl提取緩沖液提取，并通過連續流動分析儀（Skalar+Analytical,The Netherlands）測量。土壤pH用土水比1:2.5測定，并用PB-10 pH計（Sartorius,Germany）測量。土壤有機質（TOM）和TN根據標準方法測定。每個測量進行三次重復。新鮮土壤中的氧氣濃度使用OXY Meter S/N 4164不銹鋼電極傳感器（Unisense,Denmark）原位測量。潛在硝化速率的測量根據先前報告使用氯酸鹽抑制法進行。簡而言之，將5.0克土壤加入含有20毫升磷酸鹽緩沖溶液（PBS;g/L:NaCl,8.0;KCl,0.2;Na2HPO4,0.2;NaH2PO4,0.2;pH 7.4）和1 mM(NH4)2SO4的50毫升離心管中。加入終濃度為10 mM的氯酸鉀以抑制亞硝酸鹽氧化。懸浮液在25°C的黑暗培養箱中培養。亞硝酸鹽用5毫升2 M KCl溶液提取，并通過分光光度計在540 nm波長下用N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽測定。表觀潛在硝化速率根據前6小時內NO2-N濃度的線性增加計算。