化合物

化合物(1、2、3、4、沙鉑和奧沙利鉑(l-OHP))等所有鉑(IV)化合物都溶解在MEM中，制成2mM的儲(chǔ)備溶液，然后在MEM中稀釋到所需濃度。順鉑和4在使用前不久溶解在MEM中，濃度為0.4mM，然后在MEM中進(jìn)一步稀釋。

阿拉瑪藍(lán)測(cè)定

對(duì)于單層細(xì)胞的測(cè)試，CH1/PA-1、HCT116和HT1080細(xì)胞在處理前24小時(shí)從培養(yǎng)瓶中胰蛋白酶化收獲，并在MEM中播種到96孔微量培養(yǎng)板(Falcon)中，密度分別為每孔1×103個(gè)(CH1/PA-1)、2×103個(gè)(HCT116)、3×103個(gè)(HT1080)存活細(xì)胞。在三維培養(yǎng)物中進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，直接在培養(yǎng)板中處理直徑符合要求的球體。

在處理單層和球形細(xì)胞時(shí)，制備受試化合物的儲(chǔ)備溶液并逐步稀釋以獲得稀釋系列。每孔加入100mL稀釋液，然后在37℃和5%CO2下培養(yǎng)96小時(shí)。配制440mM(E110mg mL1)的復(fù)氮脲酸鈉(Sigma Aldrich)PBS新鮮溶液，每孔加入20mL。在37℃和5%CO2下染色4小時(shí)(單層實(shí)驗(yàn))或過夜(球形實(shí)驗(yàn))。

ICP-MS

化學(xué)品。ICP-MS測(cè)量的所有稀釋液均使用Milli-Q水。硝酸在石英亞沸點(diǎn)蒸餾裝置中進(jìn)一步凈化。用于ICP-MS測(cè)量的鉑和錸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購自CPI International。Tissue-Tek培養(yǎng)基用于包埋冷凍切片。所有其他試劑和溶劑均來自商業(yè)渠道，使用時(shí)無需進(jìn)一步純化。

ICP-MS測(cè)量。使用ICP-MS儀器測(cè)定了球體內(nèi)和小鼠組織中的總鉑含量。ICP-MS儀器配有CETAC ASX-520自動(dòng)進(jìn)樣器和MicroMist霧化器，樣品吸收率約為每分鐘0.25毫升1。每天對(duì)儀器進(jìn)行調(diào)試，并將錸作為鉑的內(nèi)標(biāo)，以考慮儀器波動(dòng)和基質(zhì)效應(yīng)。儀器參數(shù)見表4。數(shù)據(jù)處理使用Agilent MassHunter軟件包。

在使用LA-ICP-MS進(jìn)行生物成像時(shí)，使用三重四極桿ICP-MS Agilent 8800記錄數(shù)據(jù)，儀器參數(shù)見表4。

積聚研究樣品制備(ICP-MS)。用20mM的化合物1-4處理球形體4小時(shí)，然后收獲并轉(zhuǎn)移到1.5mL Eppendorf管中(每管10個(gè)球形體，平均直徑450毫米)。用1mL PBS沖洗3次后，用400mL HNO3裂解球形體1小時(shí)，然后用Milli-Q水灌至最終體積為8mL。使用表4中列出的儀器參數(shù)，用ICP-MS測(cè)定鉑的總含量。

用ICP-MS測(cè)定小鼠組織中的鉑濃度。使用微波系統(tǒng)Discover SP-D用亞沸騰硝酸消化小鼠組織樣本(腫瘤、腎、肝、肺、肌肉)和血液顆粒。使用的微波參數(shù)如下：溫度：200℃；斜坡時(shí)間：4分鐘；保持時(shí)間：6分鐘：消化后的樣品用Milli-Q水稀釋，使硝酸濃度低于3%，鉑濃度低于15納克g1。使用ICP-MS測(cè)定總鉑含量，儀器參數(shù)見表4。

利用LA-ICP-MS對(duì)多細(xì)胞球和小鼠腫瘤樣本進(jìn)行生物成像。用1-5mM(亞毒性濃度)化合物處理96小時(shí)后，收獲球體并將其轉(zhuǎn)移到1.5mL Eppendorf管中(每管10-20個(gè)球體)，然后用PBS沖洗3次。最后一次洗滌后，完全去除PBS，在Eppendorf管中小心地注入0.5-1mL Tissue Tek(Sakura)，然后在80℃下冷凍。用1mL胰盼藍(lán)標(biāo)記球形細(xì)胞。取出皮下異種移植物并冷凍至80℃。為了進(jìn)行LA-ICP-MS測(cè)量，使用冷凍切片機(jī)將樣本冷凍切成厚度為20毫米的薄片，放在玻璃載玻片上并風(fēng)干。用蘇木精-伊紅(H&E)染色各器官5毫米的連續(xù)切片，用于組織學(xué)評(píng)估。

使用波長(zhǎng)為213nm的Nd:YAG固體激光器來獲取鉑金在球體和腫瘤切片中的空間分布。測(cè)量前生成了感興趣區(qū)域的光學(xué)樣本圖。為確保樣品材料的完全消融，對(duì)每個(gè)樣品的輸出激光能量進(jìn)行了單獨(dú)調(diào)整。消融采用平行線掃描，線與線之間的間距為10毫米。對(duì)于腫瘤切片，頻率為10Hz，光斑大小為70mm，掃描速度為40mm/s；而對(duì)于球形樣本，激光參數(shù)調(diào)整為20Hz，光斑大小為10mm，掃描速度為10mms1。燒蝕的樣品材料以每分鐘400毫升1的流速與氦氣(質(zhì)量5.0)一起轉(zhuǎn)移到ICP-MS儀器中。使用ICP-MS儀器記錄數(shù)據(jù)，儀器參數(shù)見表4。Igor Pro軟件及其附加軟件Iolite用于進(jìn)一步處理數(shù)據(jù)和生成鉑分布圖。根據(jù)作者的手冊(cè)，采用了"Trace_Elements"數(shù)據(jù)縮減方案，包括空白減去和不平滑可視化。

缺氧檢測(cè)

用丙酮固定腫瘤切片，并按照Hypoxyprobet-1 Kit(hpi)方案進(jìn)行染色。在共聚焦顯微鏡Leica CLSM中使用在PBST中稀釋為1:1000的Alexa Flour 647標(biāo)記的二抗進(jìn)行熒光檢測(cè)。由于細(xì)胞內(nèi)聚力差，球體切片經(jīng)不起固定，而且使用Hypoxyprobet-1試劑盒需要清洗步驟，因此按照之前的描述，用HIF-1 alpha抗體對(duì)整個(gè)球體進(jìn)行染色。

缺氧室

在單層培養(yǎng)中進(jìn)行缺氧誘導(dǎo)時(shí)，將細(xì)胞播種到96孔板中，讓其附著24小時(shí)，然后在缺氧室中處理，通過氮?dú)庵脫Q將氧氣水平降至0.5%。細(xì)胞在氧氣含量為0.5%的低氧室中處理96小時(shí)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

6至8周大的雄性SCID小鼠飼養(yǎng)在無病原體環(huán)境中，所有操作均在層流氣流柜中進(jìn)行。在局部腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，將HT1080細(xì)胞(1×106個(gè))皮下注射到動(dòng)物右側(cè)腹部。動(dòng)物被隨機(jī)分配到治療組，當(dāng)腫瘤結(jié)節(jié)達(dá)到B100 mm3時(shí)開始治療。動(dòng)物分別在第4、7、11和14天接受1號(hào)(靜注8.3mg kg1，溶于5%DMSO)、2號(hào)(靜注9.1mg kg1，溶于5%DMSO)或沙鉑(靜注10mg/kg，溶于5%DMSO)治療。對(duì)照組動(dòng)物腹腔注射水。每天檢查動(dòng)物是否出現(xiàn)不適癥狀，并通過卡尺測(cè)量定期評(píng)估腫瘤大小。腫瘤體積的計(jì)算公式為(長(zhǎng)寬2)/2。

第15天，動(dòng)物接受波硝唑(60毫克千克1毫升，溶于0.9%Na.溶于0.9%氯化鈉)，30-60分鐘后處死。為此，小鼠被麻醉并通過心臟穿刺采血。

氧氣和氧化還原微電極測(cè)量

在用測(cè)量微電極時(shí)，用無菌過濾的PBS沖洗球體一次，然后用1PBS制備的1%瓊脂糖重懸。將懸浮的球體等分到預(yù)熱(37℃)的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中含有1厘米厚的PBS-瓊脂糖(1%)層。在循環(huán)水浴中進(jìn)行微電極測(cè)量時(shí)，樣品保持在37℃。

使用微電極(尖端直徑10微米；Unisense)測(cè)量氧氣和氧化還原電位曲線。微傳感器的校準(zhǔn)和測(cè)量按照制造商的說明，通過微傳感器隨附的軟件界面(Unisense)進(jìn)行。微傳感器的校準(zhǔn)使用測(cè)量前生成的兩點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線中的外部標(biāo)準(zhǔn)。

測(cè)量氧氣時(shí)，在20攝氏度下對(duì)水進(jìn)行劇烈曝氣，以獲得飽和氧氣讀數(shù)。通氣5分鐘后，停止鼓泡并記錄重復(fù)測(cè)量值。根據(jù)溶液溫度和鹽度，使用微型傳感器軟件計(jì)算飽和氧氣濃度。制備含0.1M NaOH中0.1M抗壞血酸鈉的缺氧溶液，并進(jìn)行重復(fù)測(cè)量。氧氣分布的測(cè)量步長(zhǎng)為20毫米，每步總測(cè)量時(shí)間為4秒。

氧化還原微傳感器用pH值為4.0和7.0的標(biāo)準(zhǔn)喹氫酮飽和溶液(10克/L)進(jìn)行校準(zhǔn)。氧化還原測(cè)量使用銀/氯化銀參比電極進(jìn)行。將微傳感器固定在二維微剖面系統(tǒng)(Unisense)中，并使用SensorTrace Suite軟件進(jìn)行控制，從而收集深度剖面圖。氧化還原測(cè)量的步長(zhǎng)為30毫米，每個(gè)步長(zhǎng)的總測(cè)量時(shí)間為14秒。