免疫印跡。變性電泳(SDS-PAGE)是在Mini Protean III儀器中按照Laemmli方案略加修改后進行的。每個樣品使用20微克的總蛋白質。電泳分離的樣品在4°C下以400mA電印跡1小時后轉移到硝酸纖維素(NC)膜上。NC膜在5%牛血清白蛋白(BSA)中阻斷過夜，然后用0.15%磷酸鹽緩沖鹽水(PBS-T)中洗滌，并與針對磷酸化-AMPKα(Thr172)、AMPKα、磷酸化-AKT_Ser473、磷酸化-AKT_Thr308、AKT、磷酸化-mTOR_Ser2448、mTOR、COX5A、COX2、ND4L、Actin和SBDS的特異性抗體(Abs)(4℃過夜)培養。二級HPR結合抗體在PBS-T中以1:10,000稀釋。使用ChemiDoc XRS增強化學發光檢測系統檢測抗體。使用ChemiDoc XRS進行密度分析，并將密度信號與作為管家蛋白的肌動蛋白進行比較。

Ca2+ATPase活性測定。采用酶耦合分光光度法測定25℃下細胞勻漿中的Ca2+ATPase活性，其中ATP水解與NADH氧化耦合。

克隆生成試驗。紅細胞集落和爆發形成單位生長(分別為CFU-Es和BFU-Es)的體外檢測是使用甲基纖維素培養基并輔以細胞因子進行的，具體方法見其他文獻。

細胞膜[Ca2+]i濃度計算。細胞內鈣2+濃度[Ca2+]i是用比率膜滲透熒光指示染料Fura2/AM測量的。將生長在20毫米蓋玻片上的細胞與標準PBS緩沖液中的10μMFura2/AM在37℃下培養45分鐘，然后在室溫下清洗。細胞內游離Ca2+濃度按以下公式計算：[Ca2+]i=βKd(R-Rmin)/(Rmax-R)其中R為E340/E380；Rmin為零Ca2+時的E340/E380；Rmax為Ca2+飽和溶液中的E340/E380；β為零Ca2+時的E380/Ca2+飽和溶液中的E380；Kd為室溫下染料的解離常數(140nM)。為了獲得Rmin和Rmax值，每次實驗后都要在零Ca2+浴(0Ca2+、2mM EGTA)中加入Ca2+離子拮抗劑離子霉素(2nM)，然后用飽和Ca2+溶液灌注細胞。實驗結束后，向浴槽中加入5mM MnCl2以淬滅染料的熒光并確定背景值。

結果

SDS細胞的能量代謝存在缺陷。

骨髓衰竭伴白血病演變不僅是SDS的臨床特征，也是其他遺傳性骨髓衰竭疾病(如范可尼貧血)的臨床特征。由于范可尼貧血癥細胞的呼吸作用和ATP生成率降低，導致能量代謝缺陷，而核糖體生物生成和mRNA翻譯需要大量能量，因此我們對SDS細胞的能量代謝進行了研究。

首先，我們測量了細胞內ATP和AMP的濃度，用ATP/AMP比值表示。如圖1A所示，無論是原代淋巴細胞(LYC)還是淋巴母細胞(LB)，SDS細胞的ATP/AMP比值都明顯低于對照組。特別是，我們觀察到ATP濃度降低，AMP濃度升高，這表明能量生產嚴重不足(圖1B)。事實上，在突變淋巴母細胞中表達野生型(wt)的SBDS可恢復ATP/AMP比率，這表明SBDS蛋白在能量生產中發揮作用(圖1B)。

細胞ATP的主要來源是氧化磷酸化(OXPHOS)。只有當呼吸復合體的活動與FoF1 ATP合成酶的功能耦合時，該系統才能通過耗氧產生能量。相反，在不耦合的條件下，即呼吸復合體與ATP合成酶不耦合時，氧消耗與ATP生成無關，這可能會誘發氧化應激。

為了評估氧化代謝，我們在使用丙酮酸/蘋果酸或琥珀酸刺激呼吸途徑后測量了耗氧量，這兩種底物分別與復合物I、III和IV以及復合物II、III和IV的活性有關。在對照細胞中，這兩種底物都會導致耗氧量增加(圖1C)，而在SDS細胞中，耗氧量無明顯降低，丙酮酸/蘋果酸底物的耗氧量下降不明顯(圖1D)。這些發現與較低的ATP/AMP比率一致，表明在SBDS細胞中，OXPHOS活性受損。與ATP/AMP比率類似，補體SDS細胞的耗氧量也恢復正常(圖1E)，這進一步證實了SBDS蛋白參與能量代謝和線粒體功能。

考慮到有缺陷的呼吸途徑共享復合體III和IV，我們假設在SDS中這兩個復合體之一的活性受損。雖然復合體III的活性與對照相似，但復合體IV的活性在SDS細胞中顯著降低(圖1G)，而在補體SDS細胞中則恢復正常。為支持這一發現，對照細胞中的復合體I和II活性處于正常范圍。

復合體IV由核或線粒體DNA編碼的32種蛋白質組成。為了研究復合體IV缺乏是否是由于這些蛋白質的表達量減少所致，我們選擇評估復合體IV的兩個組成部分COX5A和COX2的表達水平，它們分別由核DNA和線粒體DNA編碼。如圖1H所示，COX5A和COX2在SDS細胞中的表達水平正常，這表明復合體IV的功能缺陷似乎并不是由于蛋白質表達缺陷造成的。此外，對SDS細胞進行補體后觀察到復合體IV功能恢復正常，這表明該缺陷與SBDS蛋白缺陷有關。

為了測試哪些替代能量途徑可能支持ATP的產生，我們研究了糖酵解，它是相對于OXPHOS最常見的替代能量來源。如圖2A所示，我們發現SDS細胞的乳酸濃度(培養基中糖酵解通量的標志)顯著高于對照組和校正后的SDS細胞，這證實糖酵解途徑維持了SDS細胞的能量需求。

這組實驗證明，SDS細胞因呼吸能力下降而導致能量壓力增加，而呼吸能力下降是由復合體IV活性受損引起的，能量供應是通過激活替代糖酵解途徑提供的。特別是，這些缺陷與突變的SBDS蛋白有關，因為在細胞系中補充SBDS基因后，這些缺陷得到了恢復。

氧化磷酸化的降低會增加SDS細胞中ROS和丙二醛(MDA)的產生。

OXPHOS活性的功能性缺陷與氧化應激產物的增加有關，而在SBDS沉默細胞中，氧化應激產物增加。來自SDS患者的淋巴細胞和淋巴母細胞系都具有相似的ATP和AMP水平以及氧代謝參數；因此，為了評估氧化應激，我們在基線條件下用H2DCFH-DA染色細胞后，用細胞計數法測量了ROS，僅淋巴母細胞系暴露于100μM H2O2后進行了測量。不出所料，與對照組相比，暴露于H2O2的SDS細胞產生了更多的ROS。雖然與wt細胞(3.4±1.2)相比，SDS細胞的基線熒光(熒光任意單位)(4.2±3.1)僅略有增加，但在H2O2誘導后，這一結果明顯增加(18.7±9.4vs7.1±2.5；p>0.05)，因此表明僅在應激條件下，SDS細胞產生了過多的ROS。

ROS攻擊多不飽和脂肪酸膜，生成脂質過氧化物。作為脂質過氧化過程的生物標志物，我們測量了丙二醛(脂質過氧化物的分解產物)。如圖2B所示，SDS細胞中的MDA水平高于對照樣本(p<0.001)，從而證實了這些細胞中存在脂質過氧化反應，這是氧化應激水平增加的結果。

然而，當我們用電子顯微鏡評估線粒體形態時，并未發現SDS細胞與對照細胞之間存在任何相關差異。

總之，這些實驗表明，SDS細胞主要在受壓條件下產生過量的ROS，這可能與OXPHOS功能失調有關。這反過來又導致脂膜過氧化，但并沒有改變線粒體的形態?？傊?，這些結果似乎表明，SDS細胞中的氧化應激增加，但并不能嚴重損害線粒體結構。