摘要

SBDS基因的同形突變會導致Shwachman-Diamond綜合征(SDS)。SDS是一種罕見的遺傳性骨髓衰竭和癌癥易感綜合征。SDS細胞的核糖體生物生成和蛋白質(zhì)合成發(fā)生了改變，這是兩個高能耗的細胞過程。據(jù)報道，活性氧生成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和線粒體功能降低的變化表明，SDS細胞存在能量生成缺陷。在我們的工作中，我們證明了SDS細胞顯示出復合體IV活性受損，從而導致氧化磷酸化代謝缺陷，進而導致ATP生成減少。糖酵解速率的增加證實了這些數(shù)據(jù)，糖酵解速率的增加補償了能量壓力。此外，參與糖酵解激活的信號通路似乎也更加活化；即我們報告的AMP激活蛋白激酶過度磷酸化。值得注意的是，我們還觀察到雷帕霉素哺乳動物靶標磷酸化和細胞內(nèi)鈣濃度水平([Ca2+]i)的增加，這可能代表了SDS細胞中新的生化平衡調(diào)節(jié)。最后，還研究了SDS細胞對亮氨酸(Leu)的反應(yīng)，這表明亮氨酸可能被用作一種治療佐劑，并將在臨床試驗中進行測試。

引言

Shwachman-Diamond綜合征(SDS)是一種常染色體隱性遺傳病，其特征是胰腺功能不全、骨骼異常、骨髓衰竭以及易患骨髓增生異常綜合征(MDS)和急性髓性白血病(AML)。SDS是由SBDS(Shwachman-Bodian-Diamond綜合征)基因突變引起的，約有90%的患者患有這種疾病。與至少有一個SBDS突變體是低態(tài)性的假設(shè)相一致，基因敲除的Sbds-/-小鼠在胚胎期是致死的。

多項研究表明，SBDS蛋白定位于核仁，在核糖體生物發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。SBDS還參與其他可能與核糖體生物發(fā)生無關(guān)的分子過程，如趨化、有絲分裂紡錘體形成和細胞應(yīng)激反應(yīng)。關(guān)于后者，在SBDS缺失的人類細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激與caspase3的裂解和固有凋亡途徑的激活以及真核啟動因子2-α(eIF2-α)磷酸化有關(guān)，后者會迅速降低mRNA的翻譯啟動。最后，人體細胞中的SBDS基因沉默和酵母模型中的SBDS同源物(Sdo1)缺失都會導致線粒體功能降低。反過來，ER和線粒體應(yīng)激可能會誘導活性氧(ROS)的產(chǎn)生，導致細胞凋亡增加和生長下降。核糖體生物生成和mRNA翻譯是高能量需求過程。

本研究旨在描述SDS細胞的能量和呼吸特征以及可能調(diào)節(jié)這些過程的生化途徑。

材料與方法

細胞培養(yǎng)和處理。細胞來自"遺傳病患者細胞系和DNA生物庫"--Telethon遺傳生物庫網(wǎng)絡(luò)。所有參與中心的研究均已獲得機構(gòu)審查委員會的批準。關(guān)于細胞和細胞系的研究，在適用情況下，均已獲得患者或其親屬/監(jiān)護人的書面知情同意。所有實驗均按照批準的指南進行。

SDS和野生型淋巴母細胞系在37°C、添加10%胎牛血清和抗生素的RPMI中生長。原代淋巴細胞通過Ficoll梯度離心從血漿中分離出來，在37℃、添加10%胎牛血清、抗生素和植物血凝素(20μg/ml)的RPMI中培養(yǎng)。連續(xù)五天每天向細胞中添加一次亮氨酸(600微克/毫升)。最后一次處理一小時后，收獲細胞并用于蛋白質(zhì)提取或生化實驗。在PBS緩沖液中直接向細胞中加入Thapsigargin(TG，3μM)。

SDS校正細胞系。野生型細胞的cDNA用標準PCR擴增SBDS基因30個循環(huán)，引物如下：有義5′-taagatggaacaaaaactcatctcagaagaggatctgatgtcgatcttcacccccac-3′，無義5′-TTGATGGTGTCATTCAAATTTCTCATCTC-3′。在PCR產(chǎn)物中引入N端Myc標記(5′引物中的下劃線序列)。用TOPO®TA克隆載體系統(tǒng)I克隆Myc-SBDS，然后亞克隆到pcDNA3.1哺乳動物表達載體的KpnI/XhoI位點。通過HindIII/BamHI內(nèi)切酶消化和測序鑒定重組體。

用pCDNA-Myc-SBDS載體轉(zhuǎn)染SDS細胞系，獲得校正細胞系。轉(zhuǎn)染是按照生產(chǎn)商的說明使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胺進行的。

轉(zhuǎn)染效率通過SBDS蛋白的Western印跡分析進行評估(附圖1)。

對4個淋巴母細胞和4個淋巴細胞系進行了SDS細胞的生化鑒定。2個淋巴母細胞和2個淋巴細胞系用于亮氨酸實驗，2個淋巴母細胞系用于基因補體。

細胞勻漿制備。將培養(yǎng)細胞以1,000g離心2分鐘，去除生長培養(yǎng)基。將細胞團懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，超聲處理2次，每次10秒，在冰中休息30秒。細胞勻漿制備。將培養(yǎng)細胞以1,000g離心2分鐘，除去生長培養(yǎng)基。將細胞團懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，超聲處理2次，每次10秒，在冰中休息30秒。用Bradford方法估算總蛋白水平。

ATP/AMP比率評估。ATP和AMP的定量基于Bergmeyer等人的酶偶聯(lián)法。ATP在340nm波長下被NADP還原后進行測定。培養(yǎng)基含有50mM Tris HCl pH8.0、1mMNADP、10mM MgCl2和5mM葡萄糖，最終體積為1ml。在加入4μg純化的己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶之前和之后，對樣品進行分光光度分析。

NADH氧化后，在340納米波長處測定AMP。培養(yǎng)基中含有50微克細胞勻漿、100毫摩爾Tris-HCl(pH8.0)、75毫摩爾KCl、5毫摩爾MgCl2、0.2毫摩爾ATP、0.5毫摩爾磷酸烯醇丙酮酸、0.2毫摩爾NADH、10IU腺苷酸激酶、25IU丙酮酸激酶和15IU乳酸脫氫酶。兩次檢測均使用20微克的總蛋白質(zhì)。

評估Shwachman細胞的耗氧量。用微呼吸系統(tǒng)(Unisense A/S)在25°C的密閉室內(nèi)測量耗氧量。每次實驗使用50萬個細胞。細胞用0.3毫克/毫升的地高辛滲透1分鐘。加入10毫摩爾丙酮酸和5毫摩爾蘋果酸以刺激復合體I、III和IV通路。加入20毫摩爾琥珀酸以刺激復合體II、III和IV通路。羅替酮(0.1mM)或抗霉素A(0.2mM)分別用作第一和第二途徑的抑制劑。羅替諾酮被認為是復合物I(NADH-氧化泛醌還原酶)的特異性抑制劑，因為它能阻止電子從鐵硫中心N2轉(zhuǎn)移到泛醌。這就在線粒體基質(zhì)內(nèi)形成了電子備份。

抗霉素A是一種專門抑制細胞色素c還原酶復合體III的抗生素。它通過阻斷Cyt bH與結(jié)合在QN位點的輔酶Q之間的電子轉(zhuǎn)移來發(fā)揮作用。

呼吸復合體檢測活性。每次檢測使用20微克總蛋白。檢測采用分光光度法進行，與之前的報告相同。

細胞外乳酸鹽評估。生長培養(yǎng)基中的乳酸濃度是在340nm波長處NAD+還原后用分光光度法測定的。檢測培養(yǎng)基含有100mM Tris HCl pH8、5mM NAD+、1IU/ml乳酸脫氫酶。在加入4μg純化乳酸脫氫酶之前和之后，對樣品進行分光光度分析。數(shù)據(jù)按細胞數(shù)歸一化。

在Shwachman細胞中進行細胞測量和丙二醛評估。按照Cuccarolo等人的方法，用H2DCFDA(2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯)染色細胞后，通過流式細胞儀測量細胞暴露于H2O2和ROS誘導的應(yīng)激反應(yīng)。為了評估Shwachman細胞的脂質(zhì)過氧化情況，采用硫代巴比妥酸活性物質(zhì)(TBARS)檢測法在532nm波長下評估丙二醛(MDA)濃度。

電子顯微鏡。這項分析采用了健康供體和SDS患者的淋巴細胞顆粒。所有參與研究的中心都獲得了機構(gòu)審查委員會的批準。對于細胞和細胞系的研究，在適用的情況下，均已獲得患者或其親屬/監(jiān)護人的書面知情同意。所有實驗均按照批準的指南進行。

細胞顆粒用pH值為7.6的2.5%戊二醛/0.1M加可地酸緩沖液在室溫下固定1小時。

用1%OsO4在卡科迪酸緩沖液中固定1小時后，用乙醇系列脫水并將細胞團嵌入Epon樹脂中。用Jeol Jem-1011透射電子顯微鏡觀察用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色的超薄切片。每個樣本檢測200個線粒體。