據(jù)報道，姜黃素主要通過抑制炎癥的主要調節(jié)因子--核因子κB(NFκB)來降低細胞生長和誘導細胞凋亡，從而抑制炎癥、腫瘤生長、血管生成和轉移。最近的報道還表明，姜黃素具有潛在的代謝效應，因此我們分析了姜黃素是否以及如何影響腫瘤細胞的能量代謝。我們的研究表明，姜黃素(10μM)可抑制離體線粒體膜中ATP合酶的活性，導致ATP急劇下降，并減少體外和體內腫瘤模型的耗氧量。姜黃素對ATP合成酶的影響與抑制NFκB無關，因為IκB激酶抑制劑SC-514不會影響ATP合成酶。糖酵解酶己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的活性只受到細胞類型特異性的輕微影響。能量受損會導致腫瘤細胞活力下降。此外，姜黃素通過促進活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)(脂質氧化的標志物)的生成以及自噬誘導細胞凋亡，至少部分原因是激活了AMP激活蛋白激酶(AMPK)。根據(jù)體外抗腫瘤效果，姜黃素(30毫克/千克體重)可顯著延緩體內癌癥的生長，這可能是由于能量受損，也可能是通過減少腫瘤血管生成。這些結果證明，細胞能量代謝的核心酶ATP合酶是抗腫瘤多酚的靶點，它能抑制癌細胞生長，并全面重塑腫瘤代謝。

引言

姜黃素(diferuloylmethane；(1E,6E)-1,7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮)是從姜科植物姜黃中分離出來的一種多酚。它被用作香料，是咖喱的基本黃色成分。近年來，盡管姜黃素生物利用度低、吸收差、新陳代謝快、全身消除快，而且姜黃素治療患者的血液中檢測到的姜黃素含量很低，但許多研究都報告了姜黃素的抗腫瘤活性，甚至通過飲食給藥治療實體癌。據(jù)報道，姜黃素及其衍生物和類似物可通過影響多種細胞信號傳導途徑發(fā)揮作用，但這種多酚的主要活性是抑制IκB激酶(IkK)，使核因子κB抑制劑(IκB)穩(wěn)定在去磷酸化狀態(tài)，并以非活性形式將NFκB封閉在細胞質中。最近的研究還揭示了它作為新陳代謝調節(jié)劑的潛力，這種活性與減少炎癥和抑制NFκB有關。然而，人們很少關注姜黃素和其他多酚對癌細胞能量代謝的最終影響。

腫瘤的生長需要增加核苷酸、氨基酸和脂質等細胞構件的合成。因此，腫瘤細胞的新陳代謝具有增殖細胞的典型特征，必須滿足三個新陳代謝需求：(i)生物能，(ii)大分子生物合成和(iii)氧化還原維持。因此，癌細胞新陳代謝的特點是對葡萄糖的攝取量增加，而葡萄糖通過有氧糖酵解(沃伯格效應)優(yōu)先代謝為乳酸，盡管與氧化磷酸化相比，這一過程產生ATP的效率較低。然而，由于葡萄糖優(yōu)先分解為乳酸，腫瘤細胞可將各種糖酵解中間產物分流到支持增殖的合成代謝途徑中。短期饑餓和禁食模擬飲食可以逆轉腫瘤細胞的沃伯格效應，導致其凋亡，使腫瘤細胞對化療敏感，并增強抗腫瘤免疫監(jiān)視，從而保護正常細胞功能。有趣的是，姜黃素和綠茶提取物表沒食子兒茶素-3-棓酸鹽等多酚類物質似乎也能觸發(fā)通常由長期熱量限制或短期饑餓引起的分子通路。因此，如果姜黃素有可能模擬禁食的這些作用，那么它有望對腫瘤代謝產生重大影響。雖然尚未進行系統(tǒng)的臨床研究，但多酚類化合物抵制代謝綜合征發(fā)展的潛力已經得到證實。

姜黃素通過誘導AMP激活激酶(AMPK)降低血糖水平，并阻斷腫瘤壞死因子α(TNFα)誘導的乳腺癌細胞糖酵解。后一種作用是通過姜黃素的抗炎和抗NFκB活性發(fā)揮的。Bayet-Robert及其同事對姜黃素處理過的乳腺癌細胞進行了代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽和脂質代謝以及葡萄糖利用是多酚的主要作用靶點。谷胱甘肽的生物合成隨著姜黃素誘導的活性氧(ROS)的增加而上調。對脂質代謝的活性可能與化合物對NFκB通路的影響有關。姜黃素和其他多酚可能通過產生ROS來影響線粒體的功能，但人們很少關注這些化合物對線粒體能量代謝的影響。包括姜黃素在內的幾種多酚對正常組織線粒體ATP合成酶活性的抑制作用已被證實，但其效果取決于組織。姜黃素對細菌ATP合成酶的抑制遵循一種獨特的機制，涉及F1分子的旋轉周期。因此，姜黃素極有可能對真核生物ATP合酶產生類似作用，對細胞能量代謝產生重大影響。

我們通過分析姜黃素對癌細胞能量代謝的影響來解決這一問題。我們發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制ATP合成酶的活性，從而影響ATP/AMP比率和耗氧量，進而導致細胞活力降低、ROS生成增加、細胞凋亡和自噬。姜黃素對ATP合成酶的抑制作用在體內持續(xù)存在，并伴隨著腫瘤血管生成的減少，從而導致腫瘤生長的降低。姜黃素對ATP合成酶的影響與NFκB無關。

材料與方法

化學物質

姜黃素溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，最終濃度為100 mM，在使用前儲存在-20°C下。在體外實驗中，使用前立即將其稀釋在完全培養(yǎng)基中。活性濃度是在B16細胞的初步體外實驗中確定的。在體內實驗中，按照Pisano等人描述的方案，將劑量提高到30毫克/千克體重。姜黃素被稀釋在含1.65毫克/毫升牛血清白蛋白的無菌0.9%(w/v)氯化鈉溶液中。姜黃素稀釋液在注射前立即新鮮配制并避光保存。

細胞系和培養(yǎng)條件

L1210小鼠淋巴細胞白血病、4T1小鼠乳腺癌、B16小鼠黑色素瘤和CT26小鼠結腸腫瘤細胞系于2016年3月16日購自ATCC，并在意大利細胞系中心通過微衛(wèi)星分析進行了鑒定。所有腫瘤細胞系均在添加了1%L-谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清(完全培養(yǎng)基)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

細胞活力、凋亡和自噬的評估

在完全培養(yǎng)基中將腫瘤細胞株培養(yǎng)在12孔板中(CT26和4T1每孔1×105個，B16每孔3×104個，L1210每孔2×105個)。24小時后，用10μM的姜黃素處理細胞24小時，然后收獲細胞并用臺盼藍排除法評估細胞數(shù)量。在某些實驗中，細胞與10μM的特異性IKKβ抑制劑SC-514和姜黃素共同培養(yǎng)4小時和24小時。用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒評估細胞凋亡。為了進行自噬分析，用Lipofectamine 2000轉染了750ng pEX-HcRed-hLC3WT質粒(編碼與HcRed熒光蛋白融合的LC3B蛋白)的B16黑色素瘤細胞。72小時后，用MetOH/丙酮1:1的比例固定所有不同處理的樣本，用磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌，然后用Prolong Gold Antifade試劑固定，并用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)反染色以鑒定細胞核。

采用熒光顯微鏡對LC3B點進行定量，使用尼康相機和ACT-2U圖像軟件獲取圖像。每個實驗重復兩次，分析至少50個轉染細胞。使用100倍倍率物鏡獲取圖像。

ROS生成分析

將腫瘤細胞播種到12孔板中，并按上述方法處理。細胞用1μM氧化敏感染料2?,7?二氯熒光素二乙酸酯在磷酸鹽緩沖鹽水中染色，37°C 30分鐘，然后用FACS Calibur或Gallios細胞儀和CellQuest或Kaluza軟件分析樣本。