討論

這項實驗研究提供了新的數據，支持這樣一種觀點，即模仿OSA的慢性間歇性缺氧模式實際上會降低男性的生育能力。有趣的是，我們發現精子活力的改變甚至發生在預期較低的實驗系列中。這是在精子質量不受老化影響的最年幼的小鼠身上發現的，這些小鼠只接受了30天的間歇性缺氧，略低于小鼠精子發生的約40天持續時間。此外，最重要的結果是，在更真實地模擬OSA患者臨床狀況的動物身上觀察到的后代減少情況：中年小鼠受到長時間、慢性、間歇性缺氧的影響。

以往有關低氧對精子質量影響的實驗研究是在持續低氧條件下進行的或在動物交替處于常氧和低氧狀態下進行的，每次持續數天，以模擬對低海拔和高海拔的周期性適應過程。這些研究報告了空氣中低氧濃度引起的睪丸/精子氧化應激和其他組織學/解剖學改變。然而，在恒定或極低頻交替缺氧條件下獲得的數據并未提供有關OSA所特有的高頻間歇性缺氧對男性生育能力潛在影響的信息。因此，本研究的實驗方法專門針對這一目的。事實上，對小鼠施加的缺氧呼吸模式相當嚴重，但絕非例外，與實驗性OSA研究中采用的典型缺氧范式類似。此外，為了更好地描述整個過程，我們研究了病理生理級聯過程中不同層次的變量。首先，我們發現間歇性缺氧實際上轉化為睪丸組織中高頻率的缺氧/復氧事件(圖1)。其次，通過傳統的生物標記物評估了睪丸的相關氧化應激(圖2)。第三，我們發現精子隨后會逐漸喪失活力(圖3)。最后，通過交配試驗證明了男性生育能力的實際下降(圖4)。

睪丸局部缺氧/復氧事件是間歇性低氧供血的直接后果，應被視為隨后觀察到的精子變化的主要原因。睪丸PtO2是通過電化學微電極測量的，該微電極具有極佳的分辨率：觀察到的樣本面積小，時間響應快(直徑50μm，90%響應時間<2秒)。事實上，這種工具以前曾用于測量OSA嚙齒動物模型中其他組織(大腦、肌肉、脂肪、肝臟)的PtO2。有趣的是，我們在小鼠睪丸中獲得的約12mmHg基線值與之前在大鼠、兔子、綿羊和狗等其他物種中獲得的數據一致。睪丸PtO2的這一數值明顯低于其他組織的氧合水平：事實上，不同的報告表明，睪丸的PtO2大約是大多數相關組織數值的一半。睪丸在相對缺氧的水平下工作這一事實被歸因于精子發生過程中的新陳代謝需求導致的高耗氧量，以及睪丸增加血流量的能力減弱。因此，睪丸可能對OSA中典型的間歇性氧氣不飽和血液供應特別敏感，這反映在反復缺氧(約4mmHg nadir；圖1)導致的PtO2波動幅度相當大，可能對精子發生過程產生重要影響，進而影響生育能力。

眾所周知，各種內源性和外源性因素(如熱應激、精索靜脈曲張、糖尿病、感染、缺氧)都會導致睪丸處于氧化應激狀態。據報道，持續缺氧對睪丸產生影響的機制可能是通過誘導氧化應激，因為活性氧形成增加，氧化防御機制受損，導致生精細胞受損和凋亡。在這一過程中，缺氧和氧化應激相關基因出現上調。然而，在我們的間歇性缺氧實驗中，所分析的三個氧化應激標記中的兩個(Gpx1和Sod1)在間歇性缺氧處理的雄性睪丸中表達不足，這表明氧化保護的受損方式與持續性缺氧不同。持續缺氧會導致生殖細胞損傷和凋亡，而我們的間歇性缺氧模型則不同，它只會降低精子的運動能力和生育能力。

為了減少ROS的產生，睪丸建立了一個復雜的抗氧化系統，睪丸中的氧化應激誘導會產生一種反應，其特點是誘導SOD、GPx和谷胱甘肽轉移酶(GST)活性的mRNA物種。在SOD的存在下，它們會將超氧陰離子(O2-)迅速轉化為過氧化氫(H2O2)，以防止前者參與形成高度有害的羥基自由基。以這種方式產生的H2O2是一種強大的膜滲透性氧化劑，為了防止誘發脂質、蛋白質和DNA的氧化損傷，必須將其迅速排出細胞。H2O2的清除要么由過氧化氫酶完成，要么由谷胱甘肽過氧化物酶完成，而在睪丸中后者占主導地位。我們認為，在我們的實驗中，過氧化氫酶的水平不會受到影響，因為它在睪丸中的重要性有限。

Gpx1和Sod1表達的減少可能與精子活力和受精率(懷孕雌性減少)的降低有關。然而，間歇性缺氧組的每胎平均胎兒數并未受到影響，這表明能夠使雌性受孕的雄性精子的DNA質量足以產生正常胚胎。有報道稱，Sod1基因敲除小鼠(Sod1-KO)精子的體外受精能力低于野生型精子，但一旦受精，胚胎就能正常發育到囊胚期，這與我們的研究結果一致。有趣的是，Sod1-KO小鼠的精子在滴注培養基中培養期間，其精子運動能力逐漸下降，Sod1-KO精子中的脂質過氧化產物增加。最近又有研究表明，在與野生型雄性小鼠進行的精子競爭試驗中，Sod1-KO小鼠的體內受精成功率為零，而且與不同基因型的雌性小鼠單獨交配時幾乎完全不育。此外，與我們的間歇性缺氧小鼠一致，Sod1-KO小鼠在交配行為上沒有差異。我們認為，間歇性缺氧對睪丸造成的氧化損傷是由一些抗氧化酶的減少引起的，這些酶會導致精子的漸進運動能力和精子受精能力下降，而不會影響其他生殖特征，如精子生成、精子DNA質量或交配行為。

這項研究的數據有力地表明，間歇性缺氧通過氧化應激對直接參與精子發生的組織產生局部影響，可能會降低男性的生育能力。不過，間歇性缺氧也有可能影響到局部或全身的介質，而這些介質在調節生育能力方面發揮著作用。事實上，睪酮和卵泡刺激素是作用于睪丸以調節精子發生效率的兩種主要內分泌信號。睪酮由位于曲細精管之間的睪丸間質中的萊德細胞產生，然后擴散到曲細精管中。由于睪酮是由Leydig細胞在局部產生的，因此男性和嚙齒類動物睪丸中的睪酮水平比血清中的睪酮水平高25-125倍。雖然睪丸內高水平的睪酮可能需要在數量上維持最大的生精潛能，但在質量上，正常的生精功能只需較低的睪丸內濃度即可維持，而且睪丸內的生物可利用睪酮大大超過了通過雄激素受體(AR)與基因啟動子結合調節基因表達所需的1nM。除了以Sertoli細胞為中心的睪酮和AR作用的經典模型外，越來越多的研究發現，睪酮在其他細胞類型(包括管周肌細胞和血管平滑肌細胞)中的作用也會影響曲細精管中發生的過程。然而，由于年齡、肥胖或睡眠紊亂等混雜因素，臨床數據仍不清楚間歇性缺氧本身會如何影響OSA患者的睪酮水平。與明確顯示睡眠不足的雄性大鼠體內睪酮濃度下降的數據相反，動物研究中關于缺氧(持續或間歇)對性激素影響的證據并不確鑿，因為有報道稱缺氧后血清睪酮濃度會增加、減少或沒有變化。因此，關于睪酮對間歇性缺氧男性生育能力的具體作用缺乏數據，這也是本研究的局限性，值得進一步研究。

雖然有報道稱OSA會引起男性性功能的改變，包括動物和患者的性欲減退和勃起功能障礙，并可能受睪酮變化的影響，但目前還沒有關于生育能力的數據。除了反復發生低氧-復氧事件外，患有OSA的男性患者還面臨著其他可能對精子質量和生育能力產生負面影響的挑戰。其中一個潛在挑戰與OSA的夜間事件直接相關：伴隨大多數上氣道阻塞事件的微哮鳴音導致睡眠結構紊亂。然而，目前有關睡眠改變對男性生育能力影響的信息還很少。雖然在小鼠中實施長期睡眠限制后未發現精子參數有明顯改變，但最近的一項研究表明，在普通人群中，年輕男性自我報告的睡眠障礙與精子質量差之間存在關聯。然而，可能影響OSA患者男性生育能力的最重要的伴隨因素之一是肥胖，因為這兩種疾病經常相互關聯。據報道，肥胖本身就是一個會輕微但顯著降低其他健康男性生育能力的因素。身體質量指數(BMI)增加對男性生育能力的這種影響有幾個潛在的原因。首先，肥胖男性的生殖激素譜異常，可能會影響精子生成。其次，睪丸熱應激可能在與肥胖相關的精子發生障礙中發揮作用，因為久坐會增加坐姿的影響，以及睪丸周圍區域的脂肪堆積。鑒于肥胖會誘發全身氧化應激增加，體重指數增加可能損害男性生育能力的第三個機制是氧化應激引發的精子損傷。事實上，體重指數的增加與精子DNA損傷的適度增加有關。有趣的是，過高的體重指數和間歇性低氧血癥單獨誘發的氧化應激可能會對大部分患有OSA的男性的生育能力產生協同破壞作用。

總結

總之，這項實驗研究證明了高頻間歇性缺氧對精子功能的負面影響。要證實患有OSA的男性患者是否會導致生育能力下降，還需要在動物模型和患者身上進行后續研究。一方面，動物研究將有助于明確缺氧的劑量反應效應，或評估抗氧化藥物治療是否能減少間歇性缺氧對生殖健康的有害作用。此外，將間歇性缺氧與OSA其他典型合并癥的實驗模型相結合的動物研究(如應用實驗性睡眠片段，以及使用肥胖、糖尿病或高血壓小鼠)可能有助于探索潛在的協同效應。另一方面，對患者的研究應能揭示OSA與男性生育能力改變之間的潛在聯系。具體來說，要確定OSA患者通過常規精液圖評估的精子質量是否會下降，如果是這樣，夜間氧飽和度的常規指數(經肥胖或睡眠干擾指數等其他混雜因素校正后)是否起主要作用，并探討持續氣道正壓治療是否會改善生育能力。最后，值得注意的是，由于男性年齡與OSA患病率之間的重疊時間不斷增加，預計可能受到與睡眠呼吸障礙有關的生育問題影響的患者人數將會增加。事實上，由于肥胖癥的流行，OSA在年輕患者中的發病率將更高，而男性的年齡則有持續推遲的趨勢。具體來說，目前在不同的普通人群中，與男性生育更相關的年齡段中度到重度睡眠呼吸障礙的流行率估計從10%(30-49歲)到16%(30-39歲)和35%(40-49歲)不等。