研究簡(jiǎn)介：本文研究了毛竹（Phyllostachys edulis）枝條中縮短血紅蛋白（PeTrHb）在慢性缺氧適應(yīng)中的調(diào)控作用。毛竹枝條的快速生長(zhǎng)依賴于高效的能量代謝，但其密集的韌皮部結(jié)構(gòu)和高耗氧量導(dǎo)致內(nèi)部環(huán)境長(zhǎng)期處于慢性缺氧狀態(tài)。本研究通過(guò)測(cè)量毛竹枝條不同生長(zhǎng)階段的氧濃度、呼吸代謝，并結(jié)合RNA測(cè)序分析缺氧響應(yīng)基因表達(dá)譜，揭示了PeTrHb在維持缺氧穩(wěn)態(tài)中的潛在作用。研究發(fā)現(xiàn)，毛竹枝條內(nèi)部氧水平（0.68%–3.60%[v/v]）顯著低于土壤水中的氧水平（17.48%[v/v]），且基部低氧區(qū)域（富含分生組織的區(qū)域）與高PeTrHb1表達(dá)區(qū)域重疊。在空氣處理下，有氧呼吸僅占38%–47%，而在氮?dú)饷{迫下，乙醇濃度并未顯著增加，表明毛竹枝條可能通過(guò)非乙醇發(fā)酵途徑維持能量穩(wěn)態(tài)。PeTrHb1/2展現(xiàn)出極高的氧親和力（Ka=10^8–10^9 M^-1），其核質(zhì)定位特征表明它們可能通過(guò)結(jié)合游離氧分子來(lái)限制線粒體的氧可用性。此外，通過(guò)在毛竹和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的煙草葉片中驗(yàn)證，證實(shí)了PeTrHb1在維持缺氧下細(xì)胞活性中的關(guān)鍵作用。研究揭示了毛竹枝條在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中存在的慢性缺氧現(xiàn)象，并提出了PeTrHb1可能通過(guò)調(diào)節(jié)氧分配來(lái)維持缺氧微環(huán)境的機(jī)制，這一機(jī)制可能避免了乙醇發(fā)酵的有毒積累，并為能量代謝提供了新的途徑。這些發(fā)現(xiàn)為未來(lái)分析毛竹快速生長(zhǎng)與缺氧耐受之間的關(guān)系提供了參考，并為培育耐低氧脅迫的作物提供了潛在的靶點(diǎn)。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微電極被用于測(cè)量毛竹枝條不同部位的溶解氧濃度。將針型氧微電極從頂端分生組織向下插入1cm處，測(cè)量溶解氧濃度。將微電極水平插入第五節(jié)間中心1cm處，進(jìn)行溶解氧濃度的測(cè)量。在剝?nèi)デ屎螅瑢鞲衅魉酱┩盖驶繀^(qū)域，測(cè)量溶解氧濃度。通過(guò)精確測(cè)量毛竹枝條不同部位的氧濃度，為研究毛竹枝條內(nèi)部的氧分布情況提供了直接數(shù)據(jù)，從而證實(shí)了毛竹枝條內(nèi)部存在持續(xù)的低氧微環(huán)境，為后續(xù)研究毛竹枝條的慢性缺氧適應(yīng)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。有助于了解毛竹枝條內(nèi)部氧濃度與外部環(huán)境（如土壤水和枝條鞘）氧濃度的差異，以及不同生長(zhǎng)階段氧濃度的變化情況，進(jìn)而揭示了毛竹枝條內(nèi)部氧濃度的分布特點(diǎn)和變化規(guī)律。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究揭示了毛竹枝條通過(guò)PeTrHb介導(dǎo)的潛在協(xié)調(diào)機(jī)制，該機(jī)制可能調(diào)和了快速生長(zhǎng)期間的慢性缺氧與高能量需求之間的矛盾。盡管竹枝通過(guò)兩種途徑獲取氧氣，即竹鞘的氣孔氣體交換和根部介導(dǎo)的土壤溶解氧吸收，但由于細(xì)胞密度高、呼吸作用旺盛導(dǎo)致的氧梯度，分生組織卻發(fā)展出了持續(xù)的低氧狀態(tài)。高度表達(dá)的PeTrHb1可能會(huì)結(jié)合游離氧分子，降低細(xì)胞質(zhì)中的氧濃度，從而限制線粒體的有氧呼吸。同時(shí)，細(xì)胞核中的PeTrHb1可能會(huì)參與調(diào)節(jié)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，促使細(xì)胞依賴非乙醇發(fā)酵途徑來(lái)維持能量供應(yīng)。這種“限氧-代謝適應(yīng)”策略可能有助于支持竹枝分生組織中持續(xù)的細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)為快速生長(zhǎng)植物在缺氧條件下PeTrHb介導(dǎo)的能量代謝調(diào)控提供了新的見(jiàn)解，同時(shí)也為培育抗低氧脅迫（如水淹）的作物提供了分子靶點(diǎn)。

圖1、毛竹筍采樣和氧氣濃度測(cè)量示意圖.圖a顯示研究的四個(gè)生長(zhǎng)階段：冬筍(W)、出土前春筍(S1)、50cm春筍(S2)和150cm高春筍(S3)。圖b展示氧氣測(cè)量方法：在頂端分生組織向下1cm處(頂端測(cè)量)和從基部向上第五節(jié)的中心水平插入1cm(基部測(cè)量)進(jìn)行溶解氧濃度測(cè)定。圖c顯示吐水收集方法：用注射器收集吐水，并分析自然滲透土壤水的溶解氧濃度。

圖2、毛竹筍、土壤水、吐水和籜中的溶解氧濃度。圖a顯示不同生長(zhǎng)階段竹筍基部和頂端區(qū)域的氧氣水平，字母不同表示Tukey檢驗(yàn)顯著差異(p<0.05)。圖b比較了土壤水、吐水和籜中的氧氣濃度，顯示竹筍內(nèi)部氧氣濃度(0.68-3.60%[v/v])顯著低于土壤水(17.48%[v/v])。

圖3、空氣和氮?dú)馓幚硐旅窆S(W-S3)有氧/無(wú)氧呼吸比例及乙醇濃度分析。圖中展示了呼吸代謝特征。（a）在空氣（Air）和氮?dú)猓∟2）處理?xiàng)l件下，莖中的有氧呼吸和無(wú)氧呼吸比例（W-S3）。（b）不同處理?xiàng)l件下莖組織中的乙醇濃度。

圖4、對(duì)毛竹嫩芽中缺氧響應(yīng)基因的分析（a）GO:0001666 基因集表達(dá)的熱圖分析。樣本代碼：W_B（W 階段 - 基本型）、S1_B（S1 階段 - 基本型）、S2_B（S2 階段 - 基本型）、S3_B（S3 階段 - 基本型）；W_T（W 階段 - 頂部）、S1_T（S1 階段 - 頂部）、S2_T（S2 階段 - 頂部）、S3_T（S3 階段 - 頂部）。（b）在 W-S3 階段的不同區(qū)域中 GO：0001666 基因集中差異表達(dá)基因的表達(dá)相關(guān)性分析。FPKM < 1 的基因被排除。（c）W_T（對(duì)照）與 S1_B 之間 GO：0001666 基因集中差異表達(dá)基因的火山圖。下：顯著下調(diào)的基因；NS：無(wú)顯著差異的基因；上：顯著上調(diào)的基因（p < 0.05），|倍數(shù)變化| > 2。（d）毛竹嫩芽中 PeTrHb1 的相對(duì)表達(dá)水平。（e）W_T 和 S1_B 中 PePDC2a（PH02Gene00055）的相對(duì)表達(dá)水平。（f）W_T 和 S1_B 中 PeADH1b（PH02Gene33378）的相對(duì)表達(dá)水平。（g）在毛竹莖中，氧濃度與 PeTrHb1（PH02Gene18993）表達(dá)量之間的線性回歸關(guān)系（n = 24，R2 = 0.79093，p < 0.001）。紅色陰影表示 95% 的置信區(qū)間。（h）在毛竹莖中，氧濃度與 PePDC2a 表達(dá)量之間的線性回歸關(guān)系（n = 24，R2 = 0.42893，p < 0.001）。（i）在毛竹莖中，氧濃度與 PeADH1b 表達(dá)量之間的線性回歸關(guān)系。

圖5、對(duì)PeTrHb、血紅蛋白和O2復(fù)合物的動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果。（a）PeTrHb-血紅素-O2復(fù)合物系統(tǒng)的RMSD計(jì)算結(jié)果。（b）PeTrHb-血紅素-O2復(fù)合物系統(tǒng)的Rg計(jì)算結(jié)果。（c）PeTrHb-血紅素-O2復(fù)合物系統(tǒng)溶劑可及性SASA計(jì)算結(jié)果。（d）PeTrHb-血紅素-O2復(fù)合物系統(tǒng)中氧分子與氨基酸殘基之間氫鍵數(shù)量的計(jì)算結(jié)果。

結(jié)論與展望

毛竹筍的快速生長(zhǎng)依賴于高效的能量代謝，但其致密的韌皮部結(jié)構(gòu)和高耗氧量導(dǎo)致了慢性低氧環(huán)境。本研究測(cè)量了不同生長(zhǎng)階段竹筍的氧氣濃度、呼吸代謝，并通過(guò)RNA-seq分析了低氧響應(yīng)基因表達(dá)譜。結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬、亞細(xì)胞定位和低氧脅迫實(shí)驗(yàn)，我們鑒定了一個(gè)毛竹截短血紅蛋白(PeTrHb)并研究了其在維持低氧穩(wěn)態(tài)中的潛在作用。結(jié)果顯示，竹筍內(nèi)部氧濃度(0.68-3.60%[v/v])顯著低于土壤水(17.48%[v/v])，基礎(chǔ)低氧區(qū)(富含分生組織的區(qū)域)與PeTrHb1高表達(dá)區(qū)重疊。在空氣處理下，有氧呼吸比例僅為38-47%，但在氮?dú)饷{迫下乙醇濃度未顯著增加，這些發(fā)現(xiàn)表明竹筍可能通過(guò)非乙醇發(fā)酵途徑維持能量穩(wěn)態(tài)；PeTrHb1/2表現(xiàn)出超高的氧親和力(Ka=10?-10?M?1)，其核質(zhì)定位特征表明它們可能通過(guò)結(jié)合游離氧分子來(lái)限制線粒體氧可用性。最后，在毛竹和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的煙草葉片中驗(yàn)證了PeTrHb1在維持低氧條件下細(xì)胞活力的關(guān)鍵作用。unisense微電極精確測(cè)量毛竹枝條不同部位的氧濃度，為研究毛竹枝條內(nèi)部的氧分布情況提供了直接數(shù)據(jù)，從而證實(shí)了毛竹枝條內(nèi)部存在持續(xù)的低氧微環(huán)境，為后續(xù)研究毛竹枝條的慢性缺氧適應(yīng)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究確定了毛竹筍生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的慢性低氧現(xiàn)象，并提出PeTrHb1可能參與調(diào)節(jié)氧分配以維持低氧微環(huán)境，這種機(jī)制可能避免乙醇發(fā)酵的毒性積累，并為能量代謝提供新途徑。這些發(fā)現(xiàn)為未來(lái)分析毛竹快速生長(zhǎng)與低氧耐受性之間的關(guān)系提供了參考。