材料與方法：

動物、敗血癥模型和實驗程序：

所有研究均使用8-10周齡雄性C57BL/6小鼠。小鼠在特定的無病原體條件下飼養，水和飼料自由供應。在全身麻醉的情況下，進行1至2厘米的中線開腹手術以暴露盲腸。然后在回盲瓣遠端結扎盲腸，并用18號針頭穿刺。盲腸內容物從穿刺的盲腸中擠出，然后將穿刺的盲腸放回腹腔。腹壁切口分層縫合后，注入1mL預熱生理鹽水進行液體復蘇。假小鼠的處理方式與中毒性腹腔注射操作程序相同，但不進行腸道結扎和穿刺。這項工作已按照ARRIVE準則進行了報告。

實驗程序：

實驗1：小鼠接受假手術或CLP手術，以建立敗血癥模型。在小鼠接受手術前、手術后2小時、8小時、12小時和24小時采集肺組織。用Western印跡法檢測總PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α以及IRE1α。

實驗2：小鼠隨機分為四組：Con組、CLP組、CLP+TM組和CLP+4-PBA組。手術前1小時分別腹腔注射2mg/kg或40mg/kgBW的TM和4-PBA。術后12h檢測血清中的肺MPO活性、BLA總蛋白、肺W/D、ALT、AST、Cr和BUN。術后12h采集肺、肝和腎組織。取部分肺組織，用Western印跡法檢測總PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α、CHOP、ATF6、IRE1α和XBP1蛋白。用部分肺、肝和腎組織進行Western印跡檢測LC3、Beclin1、PINK1和Parkin。用部分肝臟組織通過TEM檢測自噬體或自溶體。部分肺、肝和腎組織通過H&E染色進行器官損傷評分。分析小鼠術前、術后1d、2d、3d、5d和7d的存活率。

實驗3：小鼠隨機分為四組：Con組、CLP組、CLP+3-MA組和CLP+Rap組。手術前1小時分別腹腔注射雷帕霉素或3-MA，劑量為10毫克/千克或15毫克/千克體重。收集肺、肝和腎組織，在手術后12小時用Western印跡法檢測p-PERK和p-eIF2α、CHOP、ATF6、IRE1α和XBP1。

實驗4：小鼠隨機分為五組：Con組、CLP組、CLP+H2組、CLP+H2+3-MA組和CLP+H2+TM組。在假手術和CLP手術后1小時和6小時腹腔注射富含H2-的生理鹽水（5mL/kg）。TM和3-MA處理同實驗2和3。術后12h檢測血清中的肺MPO活性、BLA總蛋白、肺W/D、ALT、AST、Cr和BUN。采集部分肺組織，用Western印跡法檢測NF-κb，用ELISA法檢測細胞因子TNF-α、IL1β、IL-6和HMGB1的表達。部分肺、肝和腎組織經H&E染色進行器官損傷評分。分析小鼠術前、術后1d、2d、3d、5d和7d的存活率。

詳細的實驗方案見圖1。

富氫鹽水（HRS）的生產和管理：

根據我們之前的方法，使用氫氣產生裝置在高壓（0.4兆帕）下將氫氣溶解在0.9%的NaCl中4小時，使其達到過飽和狀態。飽和富含H2的生理鹽水保存在無死體積的鋁袋中，在4°C常壓下儲存，并用γ輻射滅菌。按照Hayashida等人發表的方法，使用針式氫氣電極（UnisenseA/S，丹麥奧胡斯）檢測生理鹽水中的H2濃度。富含H2的生理鹽水每周新鮮配制一次，以確保濃度為0.6mmol/L。

器官組織病理學檢查：

實驗結束后，收集肺、肝和腎組織以檢測器官形態的變化。獲得的組織在10%緩沖福爾馬林中固定至少48小時，用石蠟包埋，并用蘇木精和伊紅染色觀察。使用ImageJ和Microsuite顯微鏡對切片進行評估。肺臟、肝臟和腎臟的組織學改變由病理學家進行盲法評估。器官的評分標準與我們之前發表的文章相同。

肺髓過氧化物酶（MPO）活性測定：

實驗結束后，采集肺組織以檢測MPO活性。對組織進行灌注、勻漿和離心，收集的上清液使用商業試劑盒通過分光光度計在590納米波長下按照制造商的說明進行測量。

肺W/D重量比：

實驗結束后，切除肺組織，剁碎，快速吸干，并按濕重稱重。然后將樣本放入60°C的烘箱中烘烤24小時，再次稱量干重。使用W/D重量比檢測肺水腫。

BAL總蛋白測定：

實驗結束后，結扎一側肺，用20mL/kg冷無菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS；pH7.2-7.4）沖洗另一側肺三次。洗液在4°C下以1000×g離心10分鐘。制備上清液，使用商業試劑盒和微孔板閱讀器在450/540納米波長下檢測總蛋白。

肝功能和腎功能檢測：

小鼠的肝功能（丙氨酸氨基轉移酶[ALT]和天門冬氨酸氨基轉移酶[AST]）和腎功能（血尿素氮[BUN]和血清肌酐[Cr]）是使用商業ELISA試劑盒和自動臨床化學分析儀按照制造商的說明進行測定的。

存活率：

術后第1、2、3、5和7天，在每天的同一時間點記錄小鼠的存活或死亡情況。

ELISA檢測：

采用ELISA法檢測血漿中的細胞因子。TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的檢測采用特定的ELISA試劑盒，微孔板閱讀器按照制造商的說明進行。

透射電子顯微鏡觀察：

采集肝臟組織，切成1立方厘米的小塊，浸泡在固定液（2.5%戊二醛）中過夜。清洗后，將組織固定在10%的緩沖戊二醛和1%的滲透酸中，脫水后嵌入Epon812中。之后，切片并在透射電子顯微鏡下觀察。通過計算每個細胞中自噬體的數量對結果進行量化。

Western印跡分析：

實驗結束后收集肺、肝和腎組織。樣本在冰上勻漿，4℃下15,000×g離心30分鐘，然后用RIPA裂解液裂解。用雙喹啉酸測定法測定所有樣本的蛋白質濃度。等量蛋白質在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠上分離，然后轉移到硝酸纖維素上。在37°C下用阻斷緩沖液（5%脫脂奶）阻斷1小時后，用以下一抗孵育薄膜：洗膜后，用辣根過氧化物酶結合的第二抗體進行孵育，37℃下1.5小時。膜洗凈后用增強化學發光試劑顯影。用QuantityOne系統軟件分析印跡灰度值。以β-肌動蛋白或組蛋白作為蛋白質樣品的負載對照，目標印跡與參考條帶的灰度比值被視為蛋白質的相對表達水平。

統計分析：

存活率采用費雪精確檢驗概率法進行分析。所有研究數據均以平均值±SEM表示。使用GraphPadPrism對多組數據進行單因素方差分析，然后進行Tukey多重比較檢驗。當P值小于0.05時，認為組間存在統計學意義。