材料與方法

菌株和種子培養物制備

本研究中使用的Penicillium decumbens JUA10由山東大學微生物技術國家重點實驗室(SKLMT)惠贈。將其保存在小麥麩皮汁斜面培養基中，該培養基包含1%(w/w)葡萄糖、10%(w/w)麩皮提取物和2%(w/w)瓊脂，于4°C保存。

Penicillium decumbens JUA10在100 mL液體培養基（包含1%(w/w)葡萄糖和10%(w/w)麩皮提取物）中，于30°C和180 rpm下預培養36小時，然后接種。

固態發酵條件

稻草生物質在4.5 L蒸汽爆破反應器（威海自控有限公司，中國威海）中，于1.5 MPa壓力下蒸汽爆破5分鐘。預處理后，將蒸汽爆破稻草(SERS)手動切碎，平均顆粒長度分別為4.0 cm、1.5 cm和0.4 cm。

固態培養基由蒸汽爆破稻草/麩皮(8.0 g/2.0 g)(w/w)和8.0 mL的1.5%(NH_4)_2SO_4、0.6%MgSO_4和0.3%KH_2PO_4無機鹽溶液組成。通過添加蒸餾水，將固態培養基的初始水分含量調整為65%、75%和85%。

在固態發酵接種前，固態底物在121°C滅菌30分鐘。滅菌后，固態底物在室溫下冷卻，并通過每克干底物添加0.5 mL種子液進行接種。固態發酵在300 mL柱狀瓶中進行，采用不同的水分含量(MC)和顆粒長度，在30°C的搖床水浴中培養120小時。每24小時取樣發酵液并進行分析。

底物形態結構測定

在柱狀瓶中，每24小時使用高分辨率相機（35毫米佳能PowerShot A650，50毫米鏡頭）檢查發酵底物底部和頂面的形態結構。^14每個樣品獲取20張數字圖像，并以JPEG格式存儲用于分析。使用120位、3264x2448像素矩陣進行圖像抓取。圖像分析方案包括使用數字圖像處理方法改進圖片，并使用MatLab 7.1計算分形維數。拍照和數字圖像處理的詳細步驟在之前的研究中有描述。^14

Penicillium decumbens JUA10生物量的測定

生物量通過葡糖胺法測定。^15，16首先，每12小時對發酵底物取樣，在80°C干燥箱中干燥，并用研缽手動粉碎。將0.5克處理過的樣品溶解在10 mL 12 mol L^{-1}鹽酸中24小時，然后加入40 mL去離子水。將混合物在121°C加熱2小時。最后，將混合物過濾，濾液溶解至50 mL，取10 mL此液體用NaOH中和，然后用去離子水溶解至25 mL。

將1.0 mL乙酰丙酮溶液（由乙酰丙酮與0.5 mol L^{-1}Na_2CO_3按1:50(v/v)比例組成）加入1.0 mL葡糖胺提取液中，混合物在90°C下保持1.0小時。室溫冷卻后，加入6.0 mL乙醇和1.0 mL Ehrlich溶液，并在65°C下保持10分鐘。在530 nm處通過比色法測定樣品。

Ehrlich試劑是通過將2.67%(w/w)4-(二甲氨基)-苯甲酸乙酯溶解在乙醇和濃鹽酸（按體積比1:1混合）的混合液體中配制而成，用于1.0 L。

底物滲透率的表征

底物滲透率每24小時使用內部實驗室設備（專利申請號201110204349.3）測定，重復三次。底物滲透率實驗在30°C下進行。

底物中氧氣分布的測定

由于微電極具有高空間精度和測量精度，使用微電極測定氧氣濃度。與普通的毫米級電極相比，它具有獨特的電化學特性，可以測量微環境的物理化學參數，并且不破壞測量點的生態環境。測量裝置微電極購自丹麥Unisense。測量系統由皮安表、連接到步進器的電機驅動微操縱器以及控制和軟件分析組成。將電極垂直刺入發酵底物。電機驅動微操縱器的速度保持在0.2 mm s^{-1}，測量距離為1.5-2.0 cm。每24小時在每組中的兩個不同點檢查發酵底物中的氧氣分布。

結果與討論

SSF底物的形態變化

我們之前的工作證明，微生物生長引起的底物形態變化可以通過固態發酵的分形動力學模型進行定量表征，并且不同條件下真菌生長引起的底物結構變化也可以通過分形維數來表達。^14為了確定固態底物變化、真菌生物量以及不同水分含量和顆粒長度的菌絲體-基質分形維數之間的關系，在SERS/麩皮培養物上每隔24小時從頂部和底部兩側拍照。還系統地定量表征了真菌生物量與分形維數之間的關系，結果如圖1和圖2所示。

在生物量轉化過程中，固態底物的水分含量(MC)和顆粒長度(PL)是影響生物量轉化效率和微生物生長的主要參數，特別是對于固態發酵。^17，18結果表明，對于所有實驗，從12小時到72小時的發酵時間內，真菌生物量迅速增加，然后在72小時到120小時的發酵時間內保持恒定值（圖1）。最大的生物量約為每克底物0.75克，在85%MC和0.4 cm PL條件下，發酵時間從12到120小時獲得（圖1）。圖1顯示，SSF中的真菌生物量在水含量實驗中遵循85%>75%>65%的順序，在顆粒長度實驗中遵循0.4 cm>1.5 cm>4.0 cm的順序。結果表明，高水分含量和小顆粒長度有利于真菌生物量的增加，可能是因為它增強了營養物質傳遞和利用效率。^19

底物形態結構因發酵過程的利用和降解作用而被真菌生長明顯改變。^20，21在使用Penicillium decumbens JUA10的SSF過程中，真菌菌絲體與底物交織在一起，形成難以分離的混合物。在先前的研究中，分形維數已被有效地用于評估真菌-底物復合物。圖2顯示，SSF中的分形維數在水含量實驗中遵循65%>75%>85%的順序，在顆粒長度實驗中遵循0.4 cm>1.5 cm>4.0 cm的順序。結果表明，高水分含量和大顆粒長度提供了最低的分形維數。同時，有趣的是，分形維數在發酵時間從12小時到48小時期間下降，然后在發酵時間從48小時到120小時期間增加。造成這種情況的可能原因是，在真菌生長的早期階段，由于真菌占據底物內部空間，分形維數降低。然而，隨著發酵時間的增加，真菌利用導致固態底物分解成小塊，這導致底物的分形維數逐漸增加。同樣有趣的是，發酵48小時后不同顆粒長度的分形維數差異小于發酵48小時前的差異（圖2(B)）。造成這種情況的可能原因是，大顆粒長度生物質在48小時后被降解成小塊。同時，小顆粒長度生物質在發酵過程中容易團聚，然后在固態發酵后期顆粒長度生物質的差異減小，這導致相應的分形維數差異也減小。因此，結果表明，分形維數可以有效地表達底物形態結構的變化，并且也可以在固態發酵中不同水分含量和顆粒長度下表征真菌生物量的相應增長。