實驗設計  

在用于實驗的12天中，每天測量一個或兩個玫瑰座，每個含有五個胚胎和一個空玻璃毛細管，測量兩次。總共測量了78個牛胚胎，在八細胞階段（第3天；n=18）和 various 囊胚階段（第7天；n=60）。第3天和第7天胚胎在不同實驗日測量。隨后對78個胚胎中的64個進行性別診斷（14個第3天胚胎；50個第7天胚胎）。我們的標準體外生產系統（實驗期間平均卵裂率和囊胚率分別為78%和42%；）作為所用胚胎質量的對照。  

統計分析  

邏輯回歸用于確定每個胚胎第一次和第二次氧氣測量之間的關聯以及氧氣梯度剖面的線性ity。

呼吸速率測試殘差的正態分布。基于這些結果，數據隨后使用混合線性模型進行統計分析，包括玫瑰座、受精后小時數、胚胎直徑、階段、形態、性別以及形態和性別的交互作用作為系統（固定）因素。模型的隨機部分包含玫瑰座和測量日期之間的交互作用。最小二乘均值（LSM）由先前模型在移除交互作用后產生，因為基于分析結果認為交互作用不顯著。  

第3天和第7天的平均呼吸速率使用混合線性模型進行統計分析，包括天數作為固定效應。LSM從先前模型生成。數據表示為LSM±標準誤。  

影響胚胎直徑的因素使用混合線性模型評估。模型包括玫瑰座、受精后小時數、胚胎形態和階段作為固定效應，以及玫瑰座和測量日期之間的交互作用作為隨機效應。  

性別比與預期50:50比通過校正卡方程序比較。  

結果  

結果 用于氧測量的胚胎性別比例 選擇用于氧測量的胚胎中，雄性與雌性胚胎的比例為64：36，與預期的50：50比例在第3天和第7天均存在顯著偏離（表1；P < 0.05）。在49例完成性別鑒定和形態學評估的囊胚中（表2），既往觀察到的性別比例（64：36）在組間（P > 0.10）和組內（P > 0.05）均無顯著差異。

氧氣測量的一致性和準確性

超微呼吸系統顯示出高準確性，在空對照毛細管內的表觀氧氣消耗可忽略不計，為 0.034 ± 0.055 nl/h (n=18)。由單個胚胎呼吸產生的梯度顯示出極好的線性（圖3），判定系數 (r2) 為 0.999。這種線性證實了 1 小時的孵化期足以在玫瑰座的玻璃毛細管內建立穩定條件。此外，每個胚胎的測量快速完成，單個呼吸速率測定在 8 分鐘內完成。

對同一胚胎進行的第一次和第二次氧氣測量結果（間隔 76 ± 8 分鐘）非常一致（圖4），兩個數據集之間的回歸得出的判定系數 (r2) 為 0.9705 (n=71; P < 0.0001)。此外，回歸線的斜率非常接近 1（即 0.978），表明第一次和第二次測量之間呼吸速率僅輕微下降了 2.2%。統計分析證實該斜率與 1 無顯著差異 (P > 0.05)，因此從第一次到第二次測量速率的輕微下降是不顯著的測量誤差。

胚胎的平均呼吸速率既不受測量中使用的玫瑰座的影響（玫瑰座 1 vs 2；P = 0.69），也不受進行測量時受精后時間的影響 (P = 0.31)。

單個胚胎的呼吸速率

第 3 天胚胎的平均呼吸速率為 0.38 ± 0.011 nl/h (n=18；范圍 0.31-0.51 nl/h)，顯著增加 (P < 0.001) 至第 7 天胚胎的 1.30 ± 0.064 nl/h (n=60；范圍 0.46-2.67 nl/h)（圖5）。

胚胎形態、性別、質量、直徑和發育階段對呼吸速率的影響

胚胎直徑直接受胚胎階段 (P < 0.01) 和形態 (P < 0.01) 的影響，因為更晚期階段和更高質量的胚胎與更大的直徑相關。

呼吸速率直接受胚胎直徑影響 (P < 0.05)，因為較大的胚胎與較高的呼吸速率相關 (y = 9.06 ± 3.71 nl/h x mm；圖6)。

對于第 7 天囊胚，呼吸速率隨形態質量成比例下降（圖7），質量 1、2、3 和 4 胚胎的呼吸速率分別為 1.72 ± 0.18a (n=18)、1.23 ± 0.14b (n=23)、1.07 ± 0.14b (n=14) 和 0.81 ± 0.22b (n=4) nl/h (a,b: P < 0.01)。質量 1 胚胎的呼吸速率最高，顯著不同于所有其他質量等級，而其他質量等級之間的呼吸速率隨質量等級下降幅度較小（圖7）。

第 3 天胚胎的平均呼吸速率在雄性和雌性之間相同 (0.38 ± 0.02 nl/h)。類似地，在第 7 天胚胎中，平均呼吸速率在性別之間沒有差異（雌性為 1.29 ± 0.12 nl/h，雄性為 1.12 ± 0.11 nl/h；P = 0.10）。

討論

本研究提供了實驗證據，證明此處描述的新型非侵入性微傳感器技術在測量單個牛胚胎的呼吸速率方面是準確、快速和可重復的。氧氣梯度表現出的優異線性以及第一次和第二次測量之間的密切關系證明了所獲結果的一致性。實際上，濃度梯度在非常接近胚胎或毛細管開口頂部時可能會偏離完美線性。然而，由于我們的測量是在距離胚胎和頂部超過 500μm 處進行的，這些偏差可以忽略不計，并且不影響梯度的線性。此外，所使用的傳感器尺寸小，不會破壞流向胚胎的氧氣通量，也不會干擾胚胎呼吸產生的氧氣梯度，這從測量到的線性氧氣梯度可以明顯看出。

采用濕潤的 5% CO? 在 19% O? 中的恒定氣流是為了確保穩定的氧氣條件，因為測量是在半封閉系統下進行的，且 19% O? 更接近正常大氣條件（21% O?）。盡管先前的研究報告稱培養期間使用的氧氣濃度會影響胚胎發育、細胞數量和基因表達，但我們認為在氧氣測量期間將胚胎轉移到不同 O? 濃度培養基中相對較短的時間不會對胚胎代謝產生顯著影響。在整個測量過程中注意到燒杯內培養基有輕微蒸發。然而，玫瑰座完全浸沒在大量培養基（80ml）中，并且如此大體積培養基的表面積與體積比相對較低，因此大量培養基體積的蒸發微不足道。