胚胎選擇、評估和加載程序  

在每個實驗日，隨機選擇五個八細胞階段（第3天）或囊胚階段（第7天）的胚胎，以代表所有形態(tài)質(zhì)量，并 individually 轉(zhuǎn)移到一個含有培養(yǎng)培養(yǎng)基的四孔培養(yǎng)皿的一個孔中。  

第3天胚胎基于細胞數(shù)（優(yōu)選八個可見細胞）、細胞大小均勻性、健康形態(tài)外觀和無碎片進行選擇。

第7天胚胎分類為早期、完整、擴張、孵化或已孵化囊胚。囊胚進行形態(tài)學評估，并根據(jù)國際胚胎移植學會（IETS 1998）給出的定義給予質(zhì)量評分（質(zhì)量1、2、3或4）。此外，每個囊胚的直徑在立體顯微鏡（SMZ800；Nikon, 日本東京）下使用目鏡測微尺測量。  

每個胚胎的數(shù)字圖像使用數(shù)碼靜態(tài)相機（GC-X3E；JVC, 日本橫濱）獲取，相機安裝在倒置光學顯微鏡（TDM；Nikon）上，帶有熱控制顯微鏡臺（CO 102；Linkam Scientific Instruments Ltd, 英國泰德沃思薩里）。  

在加載胚胎前，無菌玫瑰座放在含有5ml預平衡培養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（Nunclon dishes；Nunc）中。玫瑰座的每個毛細管手動填充1.1μl準備的孵化培養(yǎng)基，并去除任何氣泡。  

使用從2.5ml巴斯德吸管（BIE01141；Ar-Glas, Schott Glaswerke, 德國美因茨）拉出的薄玻璃毛細管，每個選定的胚胎從四孔培養(yǎng)皿中收集，并加載到玫瑰座每個玻璃毛細管的底部。玫瑰座中一個玻璃毛細管留空，作為無呼吸活動的參考測量。

隨后，玫瑰座用一對無菌鑷子放入玫瑰座盤支架中。升降臺抬起，直到玫瑰座盤支架浸入燒杯中的培養(yǎng)基中。最后，通過將塑料蓋放在燒杯上獲得半封閉系統(tǒng)。系統(tǒng)靜置，直到在玫瑰座玻璃毛細管內(nèi)建立穩(wěn)態(tài)線性氧氣梯度。  

氧氣消耗測量  

超微呼吸系統(tǒng)中使用的測量原理基于測量由胚胎在玫瑰座玻璃毛細管中呼吸產(chǎn)生的線性穩(wěn)態(tài)氧氣梯度。玻璃毛細管的小內(nèi)部尺寸和培養(yǎng)基的粘度建立了一個擴散控制系統(tǒng)，無湍流、層流或其他培養(yǎng)基的整體運動。當耗氧胚胎放在毛細管底部時，擴散空間的圓柱形狀導致系統(tǒng)達到穩(wěn)態(tài)時 largely 線性濃度梯度。使用文獻中報告的氧氣呼吸值和毛細管尺寸，可以計算典型胚胎在毛細管底部應根據(jù)菲克第一擴散定律將氧氣濃度降低約25-50%。這些預測隨后通過實驗測量玻璃毛細管內(nèi)胚胎附近的氧氣濃度驗證。

根據(jù)Crank，當Dt/l2 = 0.45時，應在時間t在毛細管中建立穩(wěn)態(tài)濃度梯度，其中l(wèi)是毛細管長度，D是氧氣的分子擴散系數(shù)。使用我們測量系統(tǒng)的適當值，我們估計生成穩(wěn)態(tài)梯度的時間約為22分鐘，假設周圍系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)且不受放置胚胎在管中的干擾。為確保測量前系統(tǒng)穩(wěn)定，我們決定將所需孵化時間增加三倍。  

大約1小時后，通過測量毛細管中連續(xù)等距測量點的氧氣濃度確定由胚胎呼吸產(chǎn)生的氧氣濃度梯度（圖2A）。記錄通過將微傳感器尖端向下移動通過充滿培養(yǎng)基的玻璃毛細管進行，以200μm步長測量深度達2500μm的信號（圖3）。對于每一步，傳感器信號由100個數(shù)據(jù)點的平均值組成，在2秒平衡后1秒內(nèi)記錄。為了獲取下一個胚胎的氧氣濃度剖面，玫瑰座盤用手動和輕柔地旋轉(zhuǎn)，使用無菌吸管將下一個毛細管定位進行分析。在每輪測量中，所有五個胚胎加上空毛細管都被測量。作為標準，進行兩輪測量，從而兩次測定每個胚胎的呼吸速率。  

基于氧氣濃度剖面計算呼吸速率 

估計呼吸速率的基礎是當將呼吸胚胎放在管底部時，在管長度上建立顯著的氧分壓降低。由于毛細管尺寸已知，傳感器測量的線性氧氣梯度可用于通過應用菲克第一擴散定律估計向胚胎的氧氣通量：  

其中dC/dx是梯度的斜率，從最后十步的記錄中獲得（圖3），D是培養(yǎng)基的擴散系數(shù)。在穩(wěn)態(tài)條件下，氧氣通量將等于毛細管中胚胎的呼吸速率。

培養(yǎng)基中氧氣的溶解度（約9%鹽度和37.0°C）計算為200μmol/l。38.5°C時培養(yǎng)培養(yǎng)基中的擴散系數(shù)同樣計算為3.37×10?? cm2/s。單個胚胎呼吸速率以nl O?/胚胎每小時（nl/h）表示。  

測量后處理胚胎和胚胎裂解  

測量后，玫瑰座用鑷子從玫瑰座盤支架中取出，放回含有培養(yǎng)基的40mm培養(yǎng)皿中。胚胎 individually 從玫瑰座轉(zhuǎn)移到含有培養(yǎng)培養(yǎng)基的四孔培養(yǎng)皿的一個孔中。隨后，單個胚胎轉(zhuǎn)移到含有500μl無Ca2?和無Mg2?磷酸鹽緩沖鹽水（Biowhittaker, 美國馬里蘭州沃克斯維爾）的四孔培養(yǎng)皿中，補充有4 mg/ml聚乙烯吡咯烷酮，使用玻璃吸管洗滌四次，并在立體顯微鏡下檢查以確保無卵丘細胞存在。此后，每個胚胎在立體顯微鏡下轉(zhuǎn)移到0.5ml反應管中，含有dNTPs（Finnzymes, 芬蘭埃斯波）、MgCl?（Finnzymes）和0.1 mg/ml蛋白酶K（Boehringer Mannheim, 德國曼海姆）在10μl PCR緩沖液（DyNazyme緩沖液；Finnzymes）中。含有胚胎的混合物覆蓋有25μl無DNA酶礦物油。樣品隨后在37°C孵化30分鐘以從胚胎細胞釋放DNA，然后蛋白酶K在98°C熱滅活8分鐘。最后，樣品存儲在4°C直到進行性別診斷。  

通過PCR進行胚胎性別鑒定  

胚胎的性別通過PCR診斷，基于Y染色體ZFY基因及其X染色體同源物ZFX的存在或缺失，裂解胚胎樣品放入PCR機中，溫度升高到初始變性步驟（94°C 3分鐘），在此期間向每個樣品中加入15μl PCR緩沖液中的引物和聚合酶。最終25μl反應混合物由10 mM Tris-HCl（pH 8.8在25°C）、50 mM KCl、1.5 mM MgCl?、0.1% Triton X-100、0.2 mM dNTPs、1.5 IU DyNazyme DNA聚合酶（Finnzymes）和10 pmol兩種引物組成。初始變性步驟后，樣品擴增50個循環(huán)如下：94°C 45秒、54°C 35秒和72°C 15-45秒。最后，樣品在72°C孵化5分鐘。

擴增后，每個PCR產(chǎn)物的10μl用5IU Pstl（Roche Diagnostics GmbH, 德國曼海姆）在37°C消化1小時。消化的PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠（MetaPhor；FMC Bioproducts, 美國羅克蘭）上分離，在1x Tris-硼酸-EDTA緩沖液中染色，含0.5μg/ml溴化乙錠。產(chǎn)生的片段在紫外燈下可視化。在牛中，Pstl將ZFY同源物切割成兩個片段（344和103 bp），而ZFX同源物的PCR產(chǎn)物（445 bp）保持完整。因此，雄性樣品從三個片段（445、344和103 bp）的存在識別，雌性從僅一個片段（445 bp）的存在識別。作為性別診斷的質(zhì)量控制，每個PCR運行中分析無模板對照和10pg雌性和雄性DNA以及胚胎樣品。