材料與方法


菌株和質粒


使用標準分子生物學方法。使用的引物列于補充材料表S2。通過使用λRed協議構建非極性突變體，使所有突變處于相同遺傳背景。為構建攜帶Δcra突變的菌株，用NEB Phusion聚合酶和引物JcraredF和JcraredR擴增PCR產物。為ΔkdpE突變，用引物kdpEARed-F和kdpEλRed-R擴增PCR產物。


為ΔfusR突變，用引物Z0463lambdaredP1和Z0463lambdaredP2擴增PCR產物。所有缺失PCR產物使用pKD4作為模板并凝膠純化（Qiagen）。然后電穿孔PCR產物到制備細胞并在S.O.C.培養基中恢復3小時于30°C，鋪板于含卡那霉素的LB培養基上于37°C過夜。然后篩選菌落對氨芐青霉素敏感性和卡那霉素抗性，并用引物對cra（KCB topo cra FW/KCB topo cra RV）、kdpE（KCB topo kdpE FW/KCB topo kdpE RV）或fusR（Z0463for/Z0463rev）PCR驗證基因缺失。為創建非極性突變體，用解析酶質粒pCP20解析卡那霉素抗性盒。電穿孔突變體與pCP20，并patch所得菌落for卡那霉素敏感性。通過測序進行最終缺失驗證。


為構建互補質粒，每個基因單獨克隆到Invitrogen pCR-Blunt II-TOPO質粒according制造商說明。用NEB Phusion聚合酶以EHEC 86-24為模板擴增PCR產物以克隆到TOPO質粒。用于擴增cra（KCB topo cra FW/KCB topo cra RV）、kdpE（KCB topo kdpE FW/KCB topo kdpE RV）和fusR（Z0463for/Z0463rev）PCR產物的引物描述于補充材料表S2。為構建互補載體使每個基因相等表達，使用NEBuilder克隆將每個基因克隆到低拷貝數質粒pACYC184中。用NEB限制酶Eco53kI線性化puc19。


以適當TOPO載體（KCB01、KCB02或KCB03）為模板，用NEB Phusion聚合酶PCR擴增每個基因如下：cra,Pcat to cra FW/Puc19 to cra RV;kdpE,pcat to kdpE FW/puc19 to kdpE RV;fusR,pcat to fusR FW/puc19 to fusR RV。以pACYC184為模板，擴增每個基因的Pcat啟動子如下：cra,puc19 to pcat FW/cra to pcat RV;kdpE,puc19 to pcat FW/kdpE to pcat RV;fusR,puc19 to pcat FW/fusR to pcat RV。線性化puc19和每個基因的PCR產物及相應Pcat啟動子PCR產物凝膠純化（Qiagen）后，在50°C孵育20分鐘與NEBuilder HiFi DNA Assembly master mix according制造商說明。然后稀釋連接產物并電穿孔到DH5α細胞。細胞在37°C恢復1小時。篩選轉化體for氨芐青霉素抗性并通過測序與M13 RV作為引物確認。這些質粒是pKCB04、pKCB05和pKCB06。


為構建pACYC184中每個單基因的互補載體，用NEB酶EcoRV和SalI消化質粒。pKCB04用SfoI和SmaI消化，pKCB05用SfoI和SalI消化，pKCB06用SfoI和SalI消化（NEB）。消化模板和相應基因凝膠純化（Qiagen）后與NEB T4連接酶在16°C過夜連接。連接產物電穿孔到DH5α細胞，允許在37°C恢復1小時。篩選轉化體for氯霉素抗性和四環素敏感性prior通過適當引物測序確認。這些質粒然后轉化到相應單缺失EHEC菌株以構建KCB07、KCB08和KCB09。


為構建剩余互補載體在低拷貝數質粒pACYC184中，再次使用NEBuilder方法制作雙和三基因互補。用NEB EcoRV線性化pACYC184并凝膠純化（Qiagen）。為制作kdpE cra互補（pKCB10），PCR擴增pKCB05模板用引物p184kdpE to cra FW和p184 to cra RV，pKCB06 PCR擴增用引物p184 to kdpE FW和p184 cra to kdpE RV。為制作fusR cra互補（pKCB11），PCR擴增pKCB04模板用引物p184 to fusR FW和p184cra to fusR RV，pKCB05模板PCR擴增用引物p184fusR to cra FW和p184 to cra RV。為制作fusR kdpE互補（pKCB12），PCR擴增pKCB06模板用引物p184 to kdpE FW和p184fusR to kdpE RV，pKCB04模板PCR擴增用引物p184kdpE to fusR FW和p184 to fusR RV。


為制作fusR kdpE cra互補（pKCB13），PCR擴增pKCB06模板用引物p184 to kdpE FW和p184fusR to kdpE RV，pKCB04模板PCR擴增用引物p184kdpE to fusR FW和p184cra to fusR RV，pKCB05模板PCR擴增用引物p184fusR to cra FW和p184 to cra RV。每個PCR產物凝膠純化（Qiagen）后與線性化pACYC184和NEBuilder HiFi DNA Assembly master mix在50°C孵育1小時。然后稀釋連接產物并電穿孔到DH5α細胞。細胞在37°C恢復1小時。篩選轉化體for氯霉素抗性和四環素敏感性prior通過適當引物測序確認。這些質粒然后轉化到相應EHEC缺失菌株以構建KCB09、KCB10、KCB11和KCB12。