研究簡(jiǎn)介:在全球變暖和隨之而來的氣候危機(jī)的時(shí)代，發(fā)現(xiàn)可持續(xù)能源載體不僅對(duì)科學(xué)與技術(shù)研究人員來說是一項(xiàng)重要事業(yè)，對(duì)全人類來說都是如此。實(shí)現(xiàn)燃料可持續(xù)生產(chǎn)的一條路徑是利用分子金屬催化劑進(jìn)行氫化反應(yīng)（HER）和CO2還原;該領(lǐng)域的研究進(jìn)展仍在持續(xù)。本研究旨在開發(fā)一種基于全新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的人工氫化酶，以實(shí)現(xiàn)可持續(xù)、高效的中性水相中產(chǎn)氫。

研究人員將鈷基分子催化劑——鈷肟（cobaloxime）通過非天然氨基酸3-甲基吡啶半胱氨酸共價(jià)連接至一個(gè)由65個(gè)氨基酸組成的三螺旋束結(jié)構(gòu)蛋白α3C上，構(gòu)建出一種全人工金屬酶（命名為復(fù)合物3）。該α3C蛋白屬于α3X家族，具有高度穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)和明確的折疊構(gòu)象，且在廣泛的pH范圍內(nèi)保持結(jié)構(gòu)完整性，是理想的人工酶支架。

研究通過MALDI-ToF質(zhì)譜、圓二色譜（CD）、紫外-可見光譜及電子順磁共振（EPR）等多種手段確認(rèn)了鈷肟成功配位于蛋白內(nèi)部，并保留了其催化活性中心的Co(II/III)氧化還原特性。電化學(xué)測(cè)試表明，該人工酶在中性緩沖液中展現(xiàn)出與游離鈷肟相似的還原電位和不可逆產(chǎn)氫峰。

更重要的是在光電化學(xué)、電化學(xué)及化學(xué)還原（使用[Eu(EGTA)]2?作為還原劑）三種條件下，該人工酶均能有效催化質(zhì)子還原生成氫氣。盡管其產(chǎn)氫轉(zhuǎn)化數(shù)（TON）約為游離鈷肟的80%，速率約為40%，但這是首次在完全從頭設(shè)計(jì)的非天然蛋白支架中實(shí)現(xiàn)多功能產(chǎn)氫催化。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白環(huán)境對(duì)催化性能具有雙重影響：一方面可能通過空間位阻或局部微環(huán)境限制底物/質(zhì)子傳輸，降低反應(yīng)速率。另一方面也可能提供一定的保護(hù)作用，增強(qiáng)催化劑穩(wěn)定性。該工作不僅驗(yàn)證了小尺寸de novo蛋白作為人工金屬酶支架的可行性，也為未來理性設(shè)計(jì)高效、可規(guī)?；?、基于地球豐產(chǎn)元素的生物啟發(fā)產(chǎn)氫系統(tǒng)提供了重要范例和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

采用Unisense公司的氫氣微傳感器來監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系中由鈷肟催化劑（游離態(tài)2或蛋白結(jié)合態(tài)3）在[Eu(EGTA)]2?還原條件下產(chǎn)生的氫氣。該傳感器被直接浸入反應(yīng)溶液中，能夠連續(xù)記錄溶解H?濃度隨時(shí)間的變化曲線。通過實(shí)時(shí)測(cè)量H?積累速率和總量，研究人員得以計(jì)算出人工酶（復(fù)合物3）與對(duì)照催化劑（復(fù)合物2）的產(chǎn)氫轉(zhuǎn)化數(shù)（TON），從而客觀比較其催化效率。測(cè)試的氫濃度數(shù)據(jù)證實(shí)了該人工酶不僅在光電催化下有效，在純化學(xué)還原條件（無光、無電極）下同樣具備HER活性，拓展了其應(yīng)用場(chǎng)景。在pH 7和8條件下分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，氫氣微電極提供的動(dòng)力學(xué)曲線揭示了產(chǎn)氫速率與[Eu(EGTA)]2?有效濃度之間的關(guān)聯(lián)，幫助解釋pH對(duì)催化性能的影響機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

α3C de novo蛋白支架已成功通過HER催化劑鈷肓功能化，以研究該分子框架對(duì)催化活性的影響。復(fù)合體3通過CD、紫外可見和EPR光譜、電化學(xué)和質(zhì)譜法進(jìn)行了表征。該蛋白-催化復(fù)合物通過光催化（使用光敏劑[Ru（bpy）3]2+和犧牲滅絕抗壞血酸，以及使用還原劑[Eu（EGTA）]2?進(jìn)行化學(xué)還原，都是一種功能性HER催化劑。根據(jù)這里的研究，α3支架似乎在一定程度上影響了她的活動(dòng)。在光化學(xué)和化學(xué)還原條件下，分子間電子從還原劑轉(zhuǎn)移到鈷氧化鈮似乎限制了氫的產(chǎn)生速率。

相比之下，鈷肟吸附于光系統(tǒng)I（PSI）的氫氣產(chǎn)生速率顯著加快。9結(jié)果顯示，2–4個(gè)非共價(jià)結(jié)合鈷酸在抗壞血酸存在下照射時(shí)，每分鐘產(chǎn)生氫350摩爾氫2/，100分鐘后產(chǎn)生5200噸氫。盡管鈷氧化肟并非共價(jià)結(jié)合，但消除擴(kuò)散和分子內(nèi)電子快速轉(zhuǎn)移使得氫的產(chǎn)生速度令人印象深刻。鑒于對(duì)PSI的研究，更高效的電子轉(zhuǎn)移到鈷氧化肟（3、SwMb和HmuO）很可能會(huì)提高氫的生成速率。除了優(yōu)化電子轉(zhuǎn)移外，將可質(zhì)子化氨基酸戰(zhàn)略性地放置在活性位點(diǎn)附近還能幫助質(zhì)子轉(zhuǎn)移，從而提高催化速率。

這一點(diǎn)在一系列使用以酪氨酸或苯丙氨酸功能化的軸向吡啶的鈷氧化鈾中觀察到。在有利的靜電環(huán)境與保護(hù)鈷氧化肟完整性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的空間功能之間存在微妙平衡，這決定了溶劑可及性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的理想折中。大自然在氫化酶（氫生成酶）中進(jìn)化出了如此平衡的結(jié)構(gòu)，使氫與質(zhì)子之間能夠以驚人的高速和效率實(shí)現(xiàn)可逆的互轉(zhuǎn)化。