研究簡(jiǎn)介:腫瘤微環(huán)境（TME）在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，其中CAFs表現(xiàn)出多種促腫瘤效應(yīng)，能夠誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸和藥物耐受性。CAFs通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子（如TGF-β、IL-6等）抑制T細(xì)胞反應(yīng)，招募免疫抑制細(xì)胞，從而形成免疫抑制性微環(huán)境。因此，調(diào)節(jié)CAFs的表型可能成為增強(qiáng)系統(tǒng)性抗腫瘤免疫的潛在策略。研究人員首先通過體外實(shí)驗(yàn)觀察氫氣對(duì)CAFs的影響，發(fā)現(xiàn)氫氣能夠減輕CAFs內(nèi)的活性氧（ROS）水平，下調(diào)一氧化氮合酶（Nos2）的表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)CAFs的促腫瘤和免疫抑制表型?；诖?，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了Mg-CaCO?系統(tǒng)，利用其在弱酸性TME中快速穩(wěn)定的氫氣釋放能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)CAFs的調(diào)節(jié)。

實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)制備了Mg-CaCO?棒，并通過掃描電子顯微鏡（SEM）、能量色散X射線光譜（EDS）和X射線衍射（XRD）等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了表征。結(jié)果顯示，Mg-CaCO?棒在pH 6.8的弱酸性環(huán)境中氫氣釋放量顯著增加，表現(xiàn)出良好的pH響應(yīng)性。在體外實(shí)驗(yàn)中，Mg-CaCO?顯著抑制了4T1腫瘤細(xì)胞的活性，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其機(jī)制是通過破壞線粒體膜電位（MMP）和擾亂細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡來實(shí)現(xiàn)的。此外，Mg-CaCO?處理的CAFs顯示出較低的ROS水平和Nos2表達(dá)，多種CAFs標(biāo)志物（如Fn1、Col1a1、Vim等）和促腫瘤因子（如Mmp2、Il-6）的表達(dá)也顯著下調(diào)。

特別是Cxcl1和Cxcl12的表達(dá)被抑制，這兩種因子與CD4?T細(xì)胞的免疫抑制表型相關(guān)。在與CD4?T細(xì)胞的共培養(yǎng)模型中，Mg-CaCO?處理的CAFs顯著降低了Foxp3的表達(dá)和Treg比例，同時(shí)增強(qiáng)了免疫激活標(biāo)志物的表達(dá)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)通過超聲成像技術(shù)監(jiān)測(cè)了Mg-CaCO?在腫瘤內(nèi)的氫氣生成能力，并通過電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）檢測(cè)了降解產(chǎn)物。結(jié)果顯示，Mg-CaCO?在腫瘤內(nèi)具有高效穩(wěn)定的氫氣生成能力，且降解產(chǎn)物不會(huì)影響全身的鈣和鎂平衡。在Balb/c裸鼠和免疫健全的Balb/c小鼠中，Mg-CaCO?顯著抑制了4T1腫瘤的生長(zhǎng)，并通過重塑CAFs表型促進(jìn)了CD4?T細(xì)胞的浸潤(rùn)。

Unisense氫電極應(yīng)用

使用Unisense氫電極來檢測(cè)Mg、Mg-CaCO?和Mg-OPSZ棒在不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中氫氣的生成情況。實(shí)驗(yàn)分別在pH 7.4（生理?xiàng)l件）和pH 6.8（模擬腫瘤微環(huán)境的弱酸性條件）下進(jìn)行。氫微電極在超純水中極化過夜，極化電壓為1000 mV。當(dāng)電壓降至50 mV以下時(shí)，電極被插入到一定體積的PBS溶液中。隨后將Mg、Mg-CaCO?或Mg-OPSZ棒加入PBS溶液中，氫氣的生成量每10秒記錄一次。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)氫氣的生成速率和總量，從而評(píng)估不同材料在不同環(huán)境條件下的氫氣釋放能力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)氫氣可逆轉(zhuǎn)癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）的免疫抑制表型，并基于此開發(fā)了一種腫瘤微環(huán)境（TME）響應(yīng)的Mg-CaCO?氫治療系統(tǒng)。該系統(tǒng)不僅能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還能通過下調(diào)CAFs中促腫瘤和免疫抑制因子（如Nos2、Cxcl1、Cxcl12等），重塑腫瘤基質(zhì)微環(huán)境，增強(qiáng)CD4?和CD8?T細(xì)胞的浸潤(rùn)與活性，將“冷腫瘤”轉(zhuǎn)化為“熱腫瘤”，從而激活系統(tǒng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)。在多種小鼠腫瘤模型中，Mg-CaCO?氫療法顯著抑制了原發(fā)瘤和遠(yuǎn)端瘤的生長(zhǎng)，提升了血清中免疫激活因子（如IFN-γ、TNF-α）水平，并與免疫檢查點(diǎn)抑制劑（αPD1）聯(lián)用展現(xiàn)出協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，顯著延長(zhǎng)小鼠生存期。Mg-CaCO?氫療法通過重塑CAFs表型和腫瘤免疫微環(huán)境，為治療免疫排斥型“冷腫瘤”提供了一種安全、有效且具備臨床轉(zhuǎn)化潛力的新策略。

圖1、泛癌CAFs的畫像及氫處理反轉(zhuǎn)CAF表型。a）不同TCGA數(shù)據(jù)集中高低CAF特征表達(dá)組的總體生存率（OS）。b）熱圖顯示不同TCGA數(shù)據(jù)集中CAF高組上調(diào)基因的富集通路。c）熱圖顯示不同TCGA數(shù)據(jù)集中CAF高組和低CAF組的關(guān)鍵免疫基因表達(dá)折疊變化。d）使用transwell體外氫處理模型示意圖。e）條形圖顯示H組DEGs通路富集，與Ctrl組相比。f，g）通過qPCR分析CAFs中CAF中CAF的MRNA水平，包括（H）或未（Ctrl）氫處理（n=3）。h）CAF表型逆轉(zhuǎn)氫處理機(jī)制的示意圖示。

圖2、Mg-CaCO3棒的制備與表征。a-d）a）Mg-Opsz棒和b）Mg-CaCO3棒的代表性SEM圖像。比例條：100和1微米，如所示。b，e）局部SEM圖像及（b）Mg-Opsz棒和e）Mg-CaCO3rods中元素的對(duì)應(yīng)分布。c-f）c）Mg-OPSZ棒和f）Mg-CaCO3rods的EDS光譜。g）制備后Mg-CaCO3rods的STEM圖像，顯示Mg、Ca、Si、O和C的元素分布。比例條=100微米。（h）Mg棒、Mg-CaCO棒和納米方解石的XRD圖譜。i）通過氫電極測(cè)量PBS中Mg、Mg-OPSZ或Mg-CaCO棒（pH 7.4和pH 6.8）的氫生成。j）通過ICP-MS測(cè)量PBS溶液中Mg、Mg-OPSZ或Mg-CaCO3棒的Mg釋放曲線。

圖3、Mg-CaCO3抗腫瘤效果的體外評(píng)估。a）4T1細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)的相對(duì)細(xì)胞存活率（n=4）。b，c）流式細(xì)胞術(shù)分析（b）及相應(yīng)定量分析（c）通過Annexin V/PI染色4T1細(xì)胞凋亡范圍（n=3）。d，e）流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定（d）及BCECF AM探針對(duì)4T1細(xì)胞pH水平的定量分析（n=3）。f）MB染色4T1細(xì)胞氫生成的定性分析。比例桿=50微米。g）對(duì)4T1細(xì)胞進(jìn)行不同處理后的熒光顯微鏡圖像，然后用JC-1染料染色。比例桿=25微米。h，i）通過DCFH-DA探針對(duì)4T1細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS水平（DCF細(xì)胞比率）進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析（h）及相應(yīng)定量分析（i）（n=3）。組別：I組：Ctrl，II：Mg，III：CaCO，IV：Mg-OPSZ，V：Mg-CaCO。統(tǒng)計(jì)顯著性通過雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算。p<0.05，p<0.01，p<0.001。顯示平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

圖4、Mg-CaCO3的CAF重塑和免疫調(diào)節(jié)作用的體外評(píng)估。a，b）流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定（a）和相應(yīng)的定量分析（b）不同處理的CAF中細(xì)胞內(nèi)ROS水平（DCF細(xì)胞比率）（n=3）。c）不同處理的CAFs的CAF標(biāo)記蛋白的Western blot分析。d）通過qPCR分析不同處理的CAF中CAF標(biāo)志物的MRNA水平（n=5）。e）通過qPCR分析不同處理的CAF中Cxcl1和Cxcl12的mRNA水平（n=5）。f，h）使用transwell的體外共培養(yǎng)模型示意圖f）不帶和h）與CD4T細(xì)胞（用bioRender.com創(chuàng)建）。g）不同處理的CAF上清液中Cxcl1和Cxcl12水平的濃度定量（n=5）。i）通過qPCR分析與不同處理的CAF共培養(yǎng)的CD4T細(xì)胞中Foxp3的MRNA水平（n=5）。j，k）流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定（k）和與不同處理的CAF共培養(yǎng)的CD4T細(xì)胞中Treg（Foxp3cell）的相應(yīng)定量分析（j）（n=5）。組：I：Ctrl，II：Mg，III：CaCO3，IV：Mg-OPSZ，V：Mg-CaCO3。

圖5、Mg-CaCO3的體內(nèi)抗腫瘤和TME重塑作用。a）用Mg-OPSZ和Mg-CaCO3棒瘤內(nèi)給藥后對(duì)4T1荷瘤小鼠進(jìn)行體內(nèi)時(shí)間依賴性超聲成像。b）基于超聲成像數(shù)據(jù)對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。c，d）不同治療7天和14天后小鼠腫瘤中的Ca（c）和Mg（d）水平（n=3）。e，i）Balb/c裸體（e）和Balb/c（i）小鼠皮下4T1小鼠腫瘤模型示意圖。f-h）不同處理后Balb/c裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線（f），腫瘤重量（g）和腫瘤抑制率（h）（n=5）。j-l）不同處理后Balb/c裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線（j），腫瘤重量（k）和腫瘤抑制率（l）（n=5）。m）不同處理后從Balb/c小鼠采集的腫瘤的H&E，Ki67，TUNEL，DCFH-DA和GSH探針染色的顯微鏡圖像。比例尺=50μm。n）不同治療后從Balb/c小鼠收集的腫瘤的IF圖像。綠色：COL1A1，紅色：CD4，藍(lán)色：DAPI，比例尺：200和50μm，如圖所示。

結(jié)論與展望

腫瘤微環(huán)境（TME）在腫瘤進(jìn)展中起著重要作用。在TME成分中，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）具有多種促進(jìn)腫瘤的效應(yīng)，并可誘導(dǎo)腫瘤免疫逃避和藥物耐藥性。調(diào)控CAFs可作為增強(qiáng)全身抗腫瘤免疫的潛在策略。研究觀察到氫處理可緩解CAFs細(xì)胞內(nèi)活性氧，重塑CAFs的腫瘤促進(jìn)和免疫抑制表型。因此基于CaCO納米顆粒涂層鎂系統(tǒng)（Mg-CaCO3）開發(fā)出可控且對(duì)TME有反應(yīng)的氫治療。

Mg-CaCO3的氫治療不僅能直接殺死腫瘤細(xì)胞，還能抑制CAFs中的促腫瘤和免疫抑制因子，從而增強(qiáng)CD4T細(xì)胞的免疫活性。原位植入時(shí)，Mg-CaCO3可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，將“冷”原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)椤盁帷蹦[瘤，并刺激系統(tǒng)性抗腫瘤免疫，由雙側(cè)腫瘤移植模型中“冷腫瘤”（4T1細(xì)胞）和“熱腫瘤”（MC38細(xì)胞）得到證實(shí)。

該氫治療系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)CAFs的免疫抑制表型，通過重塑腫瘤基質(zhì)微環(huán)境，提供系統(tǒng)性的抗腫瘤免疫刺激策略。Unisense微型氫電極通過高精度的氫氣檢測(cè)，為研究提供了氫氣生成速率和總量的定量數(shù)據(jù)。通過長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)，證明了Mg-CaCO?棒在體內(nèi)能夠持續(xù)穩(wěn)定地釋放氫氣，為氫療法的臨床應(yīng)用提供了重要依據(jù)。與超聲成像技術(shù)結(jié)合，全面評(píng)估了氫療法在體內(nèi)的效果，為后續(xù)的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)提供了有力支持。本研究證明了氫療法通過Mg-CaCO?系統(tǒng)能夠有效逆轉(zhuǎn)CAFs的免疫抑制表型，重塑腫瘤基質(zhì)微環(huán)境，并激活系統(tǒng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)。這種療法不僅直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還能通過調(diào)節(jié)CAFs增強(qiáng)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和活性，為腫瘤治療提供了一種新的策略。