4.討論

在這項(xiàng)工作中，我們評估了我們小組最近開發(fā)的H2S釋放SF支架促進(jìn)成骨分化和增加hMSCs礦物沉積的能力。我們的結(jié)果提供了證據(jù)，表明將H2S供體與SF結(jié)合可增強(qiáng)支持成骨分化的能力，并證明了H2S釋放支架可能代表一類用于骨組織再生的新型生物材料。

雖然在這項(xiàng)工作中我們沒有進(jìn)行H2S釋放SF與攜帶其他生物因子或藥物的SF基支架之間的直接比較，但我們的研究結(jié)果表明，H2S釋放SF支架具有結(jié)合骨合成代謝效應(yīng)和刺激血管生成因子能力的獨(dú)特特征；此外，H2S在生理濃度下作為一種細(xì)胞保護(hù)劑和抗氧化劑具有既定的生物活性。因此，可以想象，基于H2S的支架可能是一種有效且安全的選擇，既能刺激骨形成，又能延長骨祖細(xì)胞的壽命。

在我們之前的工作中，我們報(bào)道了一種將H2S供體GYY加入通過鹽浸法制備的SF支架的新方法。使用紅外光譜和NMR分析，證明了GYY成功地結(jié)合到SF支架中，并且GYY的H2S釋放特性至少保持2.5小時。在這里我們證實(shí)，SF基質(zhì)在水解后至少12小時內(nèi)釋放H2S，從而擴(kuò)展了我們先前的觀察結(jié)果；特別是，通過電流測量監(jiān)測的H2S釋放似乎與加載的GYY量成正比。在這項(xiàng)工作中，H2S是從支架中嵌入的緩釋H2S供體釋放的，而不是通過支架中嵌入的H2S生成酶的酶促作用化學(xué)產(chǎn)生的。通過這種方法，H2S釋放SF支架將實(shí)現(xiàn)局部和持續(xù)的H2S釋放，而不受微環(huán)境中底物量的影響。此外，我們發(fā)現(xiàn)H2S誘導(dǎo)了CSE蛋白表達(dá)的上調(diào)，CSE是負(fù)責(zé)H2S生產(chǎn)的關(guān)鍵酶之一。這種正反饋環(huán)很有趣，因?yàn)樗赡鼙砻魑h(huán)境中H2S濃度的進(jìn)一步增加，且不依賴于從支架釋放的H2S。

在這項(xiàng)工作中，為了探索SF_GYY修復(fù)骨組織的潛力，骨組織是一種堅(jiān)硬、有韌性且內(nèi)部多孔的組織，考慮到支架需要具有合適的結(jié)構(gòu)和彈性模量，以允許新組織形成并保留在指定的空間中。支架顯示出高度多孔的海綿狀結(jié)構(gòu)，孔徑最大為350μm，被認(rèn)為適用于骨組織再生應(yīng)用的支架。在骨組織愈合過程中，當(dāng)產(chǎn)生軟痂時，具有在kPa和MPa范圍內(nèi)的彈性模量的半剛性工程化基質(zhì)被認(rèn)為是支持hMSCs向成熟骨細(xì)胞分化的支架。SF和SF_GYY支架的楊氏模量值均低于成熟人骨的楊氏模量，因此該支架可作為臨時支撐，用于膠原蛋白的生產(chǎn)和ECM無機(jī)相的沉積，不應(yīng)在需要替代成熟骨的應(yīng)用中使用。

除了H2S釋放和機(jī)械性能外，生物相容性是組織工程應(yīng)用的基本要求。該支架旨在逐漸釋放一定量的H2S，從而避免突釋現(xiàn)象的風(fēng)險，突釋現(xiàn)象可能導(dǎo)致在短時間內(nèi)出現(xiàn)超生理濃度的H2S風(fēng)險。支架釋放的H2S量與生理濃度范圍（從500 nM到200μM）一致。一致地，我們的研究結(jié)果表明，GYY表面功能化對hMSCs無細(xì)胞毒性，正如我們所證明的，它保持了活力，并且不會negatively干擾細(xì)胞遷移和定殖。這些數(shù)據(jù)與H2S眾所周知的抗氧化、抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用一致，也得到我們先前研究的證實(shí)，該研究顯示H2S供體處理的hMSCs沒有細(xì)胞毒性。

此外，基于H2S公認(rèn)的促合成代謝作用，我們的支架設(shè)計(jì)的最終目標(biāo)是提高再生SF的成骨活性。據(jù)我們所知，我們的工作是第一個報(bào)道用于骨再生的H2S釋放支架的生成，因?yàn)橹伴_發(fā)的少數(shù)H2S釋放支架已用于心臟和傷口再生評估。該研究的主要發(fā)現(xiàn)是，H2S供體增加成骨分化和骨形成的能力，最近由我們和其他人報(bào)道，在此被我們的支架保留。我們發(fā)現(xiàn)SF_GYY 5%支架提前并增加了礦物沉積，無論是在hMSCs內(nèi)部還是在SF基質(zhì)上，這與以下證據(jù)一致：鈣-磷酸鹽復(fù)合物在早期階段在細(xì)胞內(nèi)的囊泡中積累，并且SF纖維模擬非膠原蛋白的陰離子性質(zhì)，從而有利于其沉積。此外，我們發(fā)現(xiàn)從SF_GYY培養(yǎng)培養(yǎng)基中收集的非粘附hMSCs，而非從對照SF支架中收集的，具有產(chǎn)生礦化基質(zhì)的能力。這些數(shù)據(jù)表明，H2S誘導(dǎo)hMSCs向成骨分化commitment，且不依賴于它們對骨傳導(dǎo)生物材料的粘附。

此外，我們表明H2S刺激激活了編碼粘附分子和蛋白、生長因子以及與骨骼發(fā)育和骨礦物代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的廣泛基因范圍。特別是，我們首次揭示了H2S分子基因表達(dá)靶點(diǎn)。我們首先發(fā)現(xiàn)SF_GYY 5%提前上調(diào)了絕大多數(shù)成骨基因，包括ALP、BMP4和成骨分化的主調(diào)控因子RUNX2，在D7時，這些基因與對照SF中的相同基因相比增加了數(shù)倍。這些數(shù)據(jù)表明，H2S釋放支架可以觸發(fā)hMSCs中導(dǎo)致成骨分化的轉(zhuǎn)錄程序的早期激活。

值得注意的是，BGLAP的表達(dá)被認(rèn)為是成骨分化和骨形成的典型晚期標(biāo)志物，在SF_GYY中也顯著增加，并在D21達(dá)到峰值，與D0相比顯著增加了6倍，與D21的對照SF相比增加了超過2倍。

先前的發(fā)現(xiàn)表明，BMP2是BMP通路的一個成員，可能是介導(dǎo)H2S對MSCs作用的重要參與者。我們的數(shù)據(jù)證實(shí)，H2S刺激顯著誘導(dǎo)了屬于BMP信號通路基因的表達(dá)。在這些基因中，DLX-5是我們分析中SF_GYY 5%最consistently上調(diào)的基因之一，與D0相比顯著增加了10倍，與D21的對照SF支架相比顯著增加了7倍。DLX-5是成骨的正向調(diào)節(jié)因子，并抑制破骨細(xì)胞分化，因此我們可以推測DLX-5可能是負(fù)責(zé)H2S先前描述的促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收作用的靶點(diǎn)之一。此外，我們的數(shù)據(jù)表明BMPR2是H2S依賴性效應(yīng)的另一個重要參與者。

在整合素中，我們發(fā)現(xiàn)ITGA2表達(dá)在D21時SF_GYY 5%中顯著高于對照SF。ITGA2與其他整合素一起，先前被描述為激活Wnt/β-catenin通路和其他信號通路，并調(diào)節(jié)成骨分化。

在細(xì)胞外基質(zhì)分子中，我們發(fā)現(xiàn)COMP在對照SF中從D0到D7顯著上調(diào)，并且其表達(dá)在SF_GYY支架中增加。COMP是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其突變導(dǎo)致骨礦物質(zhì)密度(BMD)、骨質(zhì)量、機(jī)械強(qiáng)度和軟骨下骨厚度降低；它已與BMP-2聯(lián)合使用以增強(qiáng)體外和體內(nèi)成骨。此外，SF_GYY 5%誘導(dǎo)了COL15A1的表達(dá)，該基因先前被顯示與hMSCs向成骨分化進(jìn)展相關(guān)。

有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)從D0開始，H2S顯著上調(diào)了屬于BMP通路的兩個基因，表明在實(shí)驗(yàn)的接種階段和成骨刺激之前，H2S快速實(shí)現(xiàn)了成骨commitment。盡管我們尚未研究SF_GYY 5%在體外和體內(nèi)沒有成骨因子的情況下誘導(dǎo)hMSCs長期成骨分化的能力，但這些數(shù)據(jù)使我們推測，將H2S加載到再生SF中可能使支架本身具有骨誘導(dǎo)性，而不僅僅是骨傳導(dǎo)性。異位骨形成模型的進(jìn)一步研究將闡明，未預(yù)先接種細(xì)胞的SF_GYY支架本身是否具有骨誘導(dǎo)性，從而可能彌合組織工程策略與臨床之間的差距。

最后，同樣重要的是發(fā)現(xiàn)VEGFA被H2S顯著上調(diào)。雖然先前在另一種組織中報(bào)道了H2S介導(dǎo)的VEGFA表達(dá)，但這一證據(jù)在骨組織工程領(lǐng)域具有重要意義。實(shí)際上，許多有前景的支架未能獲得臨床相關(guān)性的一個關(guān)鍵限制是，由于缺乏新血管生成或宿主血管系統(tǒng)緩慢穿透，它們的整合存在缺陷。通過促進(jìn)ALP和其他多種成骨標(biāo)志物的表達(dá)，并通過誘導(dǎo)hMSCs產(chǎn)生VEGF，H2S釋放SF可能構(gòu)成一種創(chuàng)新的功能化策略，可以在促進(jìn)新血管生成的同時實(shí)現(xiàn)成骨，特別是在局部H2S耗竭的病理狀況下。

5.結(jié)論

本研究證明，將SF支架加載H2S供體是促進(jìn)骨再生部位成骨分化的合適策略。H2S釋放觸發(fā)無機(jī)礦物基質(zhì)的沉積，并促進(jìn)hMSCs表達(dá)成骨基因和生產(chǎn)促血管生成因子。我們得出結(jié)論，H2S可以顯著提高基于SF生物材料的現(xiàn)有骨組織工程方法的efficacy。