討論

Methylomicrobium album菌株BG8僅在低氧和NO??存在下產(chǎn)生氧化亞氮

M.album BG8的分批培養(yǎng)清楚地表明，無(wú)論是NO??還是低O?都是脫氮作用（以氧化亞氮產(chǎn)量衡量）所必需的。雖然先前的研究已在終點(diǎn)測(cè)定中表明M.album菌株BG8的分批培養(yǎng)物能夠產(chǎn)生氧化亞氮，但其脫氮作用的機(jī)制和所需條件直到現(xiàn)在才得以確定。M.denitrificans FJG1的氧化亞氮產(chǎn)生也被證明依賴(lài)于低氧條件；然而，該菌株可能由于存在一個(gè)在M.album菌株BG8基因組中缺失的narGHJI異化硝酸還原酶，除了能利用NO??外，還能呼吸NO??。M.album菌株BG8的基因組編碼推定的異化亞硝酸鹽還原酶（nirS）和一氧化氮還原酶（norB），類(lèi)似于M.denitrificans FJG1；因此，M.album菌株BG8產(chǎn)生的氧化亞氮很可能來(lái)自通過(guò)NO中間體將NO??酶促還原為氧化亞氮。

氧化亞氮產(chǎn)生與低O?張力之間的相關(guān)性類(lèi)似于其他兩種微生物過(guò)程：化能有機(jī)異養(yǎng)菌（如Paracoccus denitrificans）中的好氧脫氮作用和氨氧化細(xì)菌中的硝化菌脫氮作用。化能有機(jī)異養(yǎng)菌中的好氧脫氮作用和氨氧化細(xì)菌中的硝化菌脫氮作用是在O?限制期間最大化呼吸作用或消耗多余還原力的一種策略。在M.album菌株BG8的呼吸鏈中，結(jié)合使用或替代使用O?來(lái)利用NO??，將降低細(xì)胞整體的O?需求，從而為額外的CH?氧化節(jié)省O?。因此，M.album菌株BG8可能在O?限制下使用NO??作為末端電子受體以最大化總呼吸作用。M.album菌株BG8從NO??產(chǎn)生的氧化亞氮產(chǎn)率百分比（5.1±0.2%）與Nitrosomonas europaea ATCC 19718（約4.8%）相似，比Nitrosospira multiformis ATCC 25196（0.27±0.05%）高一個(gè)數(shù)量級(jí)。

M.album菌株BG8的脫氮作用由多種還原劑源酶促支持

M.album菌株BG8的靜息細(xì)胞以四種測(cè)試的C1底物（CH?,CH?OH,CH?O,HCO?H）、兩種C2底物（C?H?,C?H?O）和NH?Cl為代價(jià)，將NO??還原為氧化亞氮。這些數(shù)據(jù)表明，甲烷氧化途徑的中間體以及pMMO、MDH和可能的羥胺脫氫酶的共底物支持呼吸性脫氮作用。這些結(jié)果與之前對(duì)甲烷氧化菌Methylocystis sp.菌株SC2的研究一致，該菌在缺氧條件下將CH?OH氧化與脫氮作用相耦合。值得注意的是，我們測(cè)試的兩種C2化合物——C?H?和C?H?O——都支持脫氮作用。甲烷氧化菌利用C2化合物支持脫氮作用的能力可能具有環(huán)境意義，因?yàn)樘烊粴庵泻屑s1.8-5.1%（v/v）的乙烷。此外，乙醇是初級(jí)發(fā)酵菌在有機(jī)化合物厭氧分解過(guò)程中的重要產(chǎn)物。結(jié)果還表明，從NH?氧化為NO??衍生的電子被M.album菌株BG8中的亞硝酸鹽和一氧化氮還原酶有效利用，這代表了甲烷氧化菌產(chǎn)生氧化亞氮的另一種途徑，該途徑不直接依賴(lài)于單碳代謝，前提是甲烷單加氧酶可以獲得內(nèi)源性還原力。

瞬時(shí)O?消耗和氧化亞氮產(chǎn)生的測(cè)量結(jié)果為C1-C2底物和氨的分解代謝在M.album菌株BG8中與低氧條件下的NO??還原直接耦合提供了強(qiáng)有力的支持。一些好氧甲烷氧化菌發(fā)酵CH?并排泄有機(jī)化合物，如檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽和乳酸鹽。一些研究還表明，脫氮作用僅發(fā)生在以甲烷喂養(yǎng)的含有甲烷氧化菌和反硝化菌的共培養(yǎng)物中，因?yàn)檫^(guò)去認(rèn)為甲烷氧化菌無(wú)法厭氧分解有機(jī)化合物。盡管M.album菌株BG8在提供CH?的缺氧條件下可能排泄有機(jī)化合物，但CH?OH、CH?O、HCO?H、C?H?、C?H?O或NH?氧化支持脫氮作用的能力明確證明了甲烷氧化菌特異性酶學(xué)與單個(gè)生物體內(nèi)脫氮活性之間的聯(lián)系。

預(yù)測(cè)的脫氮基因nirS和norB1的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)NO??而增加，但不響應(yīng)低氧

好氧甲烷氧化菌中nirS同源物的表達(dá)迄今為止僅在呼吸NO??的M.denitrificans FJG1中被研究過(guò)。有趣的是，M.denitrificans FJG1的基因組同時(shí)編碼含銅的（nirK）和含細(xì)胞色素cd1的（nirS）亞硝酸鹽還原酶，并且只有nirK的穩(wěn)態(tài)mRNA水平在同時(shí)響應(yīng)O?限制和NO??可用性時(shí)增加。就只擁有nirS同源物的M.album菌株BG8而言，我們表明該nirS轉(zhuǎn)錄本的豐度對(duì)NO??處理呈陽(yáng)性響應(yīng)，但對(duì)O?限制無(wú)響應(yīng)。這表明僅NO??的可用性就能引發(fā)nirS的表達(dá)，盡管缺氧是NO??還原發(fā)生所必需的。

細(xì)胞色素c依賴(lài)性一氧化氮還原酶（norB）在好氧甲烷氧化菌的基因組中廣泛存在。這部分可能是由于需要通過(guò)將其還原為氧化亞氮來(lái)解毒在好氧氨氧化過(guò)程中產(chǎn)生的NO。在用0.5 mM硝普鈉（一種釋放NO的化合物）處理后，Methylococcus capsulatus菌株Bath中norB的表達(dá)增加了4.8倍。由于該基因組缺少異化亞硝酸鹽還原酶，NorB蛋白可能參與了M.capsulatus菌株Bath氨氧化過(guò)程中的NO解毒作用。最近，在恒化器生長(zhǎng)期間，證明M.fumariolicum菌株SolV中norB的轉(zhuǎn)錄在O?限制下上調(diào)；然而，尚不清楚M.fumariolicum菌株SolV是否可以消耗NO??或NO。M.denitrificans FJG1中norB的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)NO??和低氧而增加了2.8倍。雖然M.album菌株BG8的基因組編碼兩個(gè)拷貝的norB基因，但只有一個(gè)拷貝（norB1）后面跟著norC——必需的含細(xì)胞色素c的亞基。盡管一些生物體如Cupriavidus necator擁有兩個(gè)獨(dú)立的功能性一氧化氮還原酶，但目前的工作表明，只有norB1在M.album菌株BG8中的表達(dá)對(duì)NO??處理有響應(yīng)。盡管NorB的功能在M.album菌株BG8和M.capsulatus菌株Bath之間可能不同，但這兩種細(xì)菌都顯示出norB基因?qū)O??的相似轉(zhuǎn)錄響應(yīng)。

pxmA的轉(zhuǎn)錄本豐度響應(yīng)NO??和低氧而顯著增加

屬于γ-變形菌門(mén)的一些好氧甲烷氧化菌的基因組已被證明編碼一個(gè)序列差異的CuMMO蛋白復(fù)合物，即pXMO。由pxm操縱子編碼的推定性pXMO蛋白的功能和底物仍然未知。先前對(duì)pxm操縱子的研究表明，它在Methylomonas sp.菌株LW13以及淡水泥炭沼澤和小溪沉積物中生長(zhǎng)時(shí)以低水平表達(dá)。對(duì)油砂尾礦池中SIP標(biāo)記的活性群落的宏基因組測(cè)序顯示，pxmA序列存在于活性甲烷氧化菌群落中。對(duì)M.denitrificans FJG1轉(zhuǎn)錄組的分析表明，pxmABC操縱子的穩(wěn)態(tài)mRNA水平響應(yīng)脫氮條件增加了約10倍。

我們現(xiàn)在證明，M.album菌株BG8中pxmA的表達(dá)響應(yīng)NO??和低氧而顯著增加。我們?cè)谖窗l(fā)生脫氮作用的O?限制的單獨(dú)NMS培養(yǎng)物中未觀察到pxmA表達(dá)的任何增加，這表明僅低氧不足以增加穩(wěn)態(tài)mRNA水平。這項(xiàng)研究進(jìn)一步支持了pxmA表達(dá)對(duì)脫氮條件有響應(yīng)的觀察結(jié)果。然而，必須指出，在添加NO??的培養(yǎng)基中，pxmA的絕對(duì)轉(zhuǎn)錄本豐度比pmoA的絕對(duì)轉(zhuǎn)錄本豐度低三個(gè)數(shù)量級(jí)。

結(jié)論

本研究證明了一種好氧甲烷氧化菌——M.album菌株BG8——在O?限制下，將C1（CH?,CH?OH,CH?O,HCO?H）、C2（C?H?,C?H?O）和無(wú)機(jī)（NH?）底物的氧化與NO??還原相耦合，導(dǎo)致強(qiáng)效溫室氣體氧化亞氮的釋放。將C1、C2和無(wú)機(jī)能源與O?呼吸和脫氮作用相耦合的能力賦予了M.album菌株BG8相當(dāng)大的代謝靈活性。我們提出了一個(gè)M.album菌株BG8中甲烷驅(qū)動(dòng)脫氮作用的模型（圖6）。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)甲烷氧化細(xì)菌在全球氮循環(huán)中，無(wú)論是在氧化亞氮排放還是氮損失方面，的環(huán)境作用具有啟示意義。將呼吸NO??的M.album菌株BG8的基因組和生理學(xué)與呼吸NO??的M.denitrificans FJG1進(jìn)行比較表明，M.album菌株BG8無(wú)法將NO??還原為氧化亞氮可能是由于其基因組中缺少異化硝酸還原酶，但推定的脫氮基因nirS和norB1的表達(dá)使這種好氧甲烷氧化菌能夠呼吸NO??。