RNA提取

從在NMS或NMS+NO2-培養基中生長24、48和72小時的約10^9個M.album菌株BG8細胞中提取總RNA。細胞通過0.22μm過濾器過濾收獲，并用酚-乙醇終止溶液滅活。根據制造商說明書純化總核酸，并進行以下修改：細胞裂解步驟中加入6 U蛋白酶K，總沉淀核酸用30單位DNase I處理。然后使用RNA clean&concentrator對總RNA進行柱純化。使用BioAnalyzer和Qubit評估RNA質量和數量。通過針對norB1或nirS基因的定量PCR評估殘留基因組DNA污染。使用M.album菌株BG8的基因組DNA和通用及基因特異性引物創建基因拷貝標準品。根據制造商說明，使用SuperScript III逆轉錄酶將總RNA逆轉錄為cDNA。

表 1 | 本研究中使用的 qPCR 引物

基因靶標	基因座標簽	引物組	序列 (5'→3')	qPCR 效率	標準曲線-R2	參考文獻
pxmA	METAL_RS06980	QpxmA-FWD-3 QpxmA-REV-3	GCTTGTCAGGGCTTACGATTA CTTCCAGTCCACCCAGAAATC	97.7%-101.8%	0.9989	本研究
pmoA	METAL_RS17425	QpmoA-FWD-7 QpmoA-REV-7	GTTCAAGCAGTTGTGTGGTATC GAATTGTGATGGGAACACGAAG	95.1%-97.2%	0.9999	本研究
nirS	METAL_RS10995	QnirS-FWD-1 QnirS-REV-1	GTCGACCTGAAGGACGATTT GTCACGATGCTGTCGTCATA	95.1%-98.8%	0.9999	本研究
norB1	METAL_RS03925	QnorB-FWD-2 QnorB-REV-2	ACTGGCGGTGCACTATTT CATCCGGTTGACGTTGAAATC	97.2%-97.4%	0.9998	本研究
norB2	METAL_RS13345	QnorB-F-1 QnorB-R-1	CACCATGTACACCCTCATCTG CCAAAGTCTGCGCAAGAAAC	96.2%-102.2% 96.1%-101.8%	0.9999 0.9999	本研究 本研究
16S rRNA	METAL_RS04240	341F 518R	CCTACGGGAGGCAGCAG ATTACCGCGGCTGCTGG	96.9%-102.2%	0.9997	Muyzer et al.,1993

定量PCR

使用M.album菌株BG8的基因組DNA和通用及基因特異性引物創建基因拷貝標準品。

制備純化擴增產物的10倍稀釋系列，用于建立優化的qPCR條件。每個20μl反應包含10μl 2X qPCR SYBR預混主試劑、0.2 uM正向和反向引物、1 ul稀釋的cDNA和無核酸酶水。在StepOne Plus qPCR系統上進行擴增，初始活化95°C 3分鐘，然后進行40個循環的擴增（95°C 15秒，60°C 15秒，72°C 15秒）并收集熒光發射數據。通過熔解曲線分析評估靶標特異性，確保獲得單峰。從稀釋10^-3至10^-5的cDNA估計16S rRNA和pmoA轉錄本分析的基因拷貝數，從稀釋10^-1至10^-3的cDNA估計nirS、norB1、norB2和pxmA轉錄本分析的基因拷貝數。每個功能基因的轉錄本豐度均歸一化為16S rRNA的轉錄本豐度，得到每十億個16S rRNA拷貝的轉錄本拷貝數。然后，為了計算N倍變化，我們將NMS+NO2-培養物中的轉錄本豐度除以NMS培養物中的轉錄本豐度。樣品在至少三個在不同日期生長和處理的生物學重復上，每個重復進行三次稀釋，每個稀釋度運行三次技術重復。定量PCR效率范圍在95-102%之間，所有檢測的r2值至少為0.99。

統計學

使用學生t檢驗（雙尾）計算對照組和實驗組重復之間的P值。使用雙樣本F檢驗確定對照組和實驗組之間的方差相等性。倍增時間、O2和CH4消耗、細胞密度以及總頂空O2和CH4消耗量在對照組和實驗組之間具有相等的方差；因此，對上述比較計算了同方差性t檢驗。對于qPCR，在48小時時，NMS+NO2-與單獨NMS之間對pmoA、pxmA、nirS和norB1的比較，以及在72小時時對pxmA和nirS的比較顯示方差不相等；因此，使用異方差性t檢驗計算這些比較的P值。在所有其他時間點，所有其他基因的NMS+NO2-與單獨NMS之間的方差是相等的。

結果

在不存在或存在NO2-條件下Methylomicrobium album菌株BG8的生長表型

在120小時內培養Methylomicrobium album菌株BG8，以確定NO2-對生長、O2和CH4消耗以及N2O產生的影響（圖1）。保持總氮量恒定以消除處理間氮可用性和鹽濃度的差異。所有培養物起始的氧氣張力為19.5±0.7%（圖1B）。正如先前觀察到的，添加NO2-對M.album菌株BG8的生長或底物消耗沒有抑制作用（圖1A-C）。所有培養物中的限制性底物是O2，這通過在生長48小時后向培養物補充額外的O2并觀察到與未接收額外O2的培養物相比光密度顯著增加來證明。N2O的產生僅發生在NMS加NO2-的培養物中（圖1D）。當O2達到頂空的約1.8%時，在添加NO2-的培養物頂空中首次出現N2O產生，并以每小時每個細胞9.3×10^-18 mol N2O的速率持續到實驗結束（120小時）（圖1D）。生長120小時后，在NMS+NO2-培養物中，添加的NO2-的N2O產率百分比為5.1±0.2%。

靜息細胞在大氣和低氧O2張力下利用單一或雙碳底物或銨鹽的O2消耗和N2O產生

為了確定支配M.album菌株BG8中N2O產生的條件，我們測量了以CH4作為唯一碳源和能源的M.album菌株BG8的瞬時O2消耗和N2O產生。將CH4引入腔室立即導致O2消耗；約3分鐘后O2下降至微電極檢測限以下（圖2A）。向腔室中添加NO2-導致在O2下降至檢測限以下后不久產生N2O（圖2B）。在沒有NO2-的情況下，我們未觀察到可測量的N2O產生（圖2A）。盡管當N2O明顯時O2濃度低于50 nM，但重要的是要注意M.album菌株BG8仍然需要O2進行甲烷氧化，并且不能在缺氧條件下生長。

使用上述相同的設置，我們向MR腔室中的靜息細胞補充CH3OH、CH2O、HCO2H、C2H6或C2H6O，以通過實驗驗證除CH4以外的其他碳基還原劑源是否支持M.album菌株BG8的脫氮作用。此外，為了證實我們測試的所有一碳和兩碳源都可以在缺氧條件下作為M.album菌株BG8脫氮作用的直接電子供體，我們向靜息細胞提供僅夠消耗MR腔室中存在的溶解O2的還原劑，而不留多余的還原劑來支持脫氮作用（圖3）。然后，我們通過向含有補充了NaNO2的培養基的MR腔室中連續添加少量CH4、CH3OH、CH2O、HCO2H、C2H6或C2H6O來測量瞬時N2O產生（圖3）。對于所有六種底物，N2O的產生與添加的底物量是化學計量關系的（圖3）。

許多甲烷氧化菌，包括M.album BG8，由于與氨氧化細菌具有同源基因庫，可以將NH3氧化為NO2-。我們旨在測試來自NH3氧化的還原劑和NO2-是否也能驅動M.album菌株BG8的脫氮作用。將NH4Cl注入MR腔室后，腔室中的靜息細胞迅速消耗溶解O2（圖4）。約70分鐘后，生物質將溶解O2消耗至<50 nM，NO2-濃度達到163±5μM。O2耗盡后N2O的產生速率為每小時每個細胞1.2 x 10^-18 mol。

在脫氮條件下M.album菌株BG8中預測的脫氮基因的表達

M.album菌株BG8的基因組編碼幾個預測參與脫氮作用的基因。呼吸脫氮作用的第一步是將NO3-單電子還原為NO2-；這一反應由兩種膜相關異化硝酸還原酶之一執行，但M.album菌株BG8的基因組中未編碼任何一種。脫氮作用的第二步，將NO2-單電子還原為NO，由兩種非同源性的亞硝酸鹽還原酶之一執行，即含銅的亞硝酸鹽還原酶或含細胞色素cd1的亞硝酸鹽還原酶，其中后者在基因組中被注釋。M.album菌株BG8的基因組還包含兩個拷貝的推定性細胞色素c依賴性一氧化氮還原酶。我們還研究了pxmABC操縱子中pxmA基因的表達，該操縱子編碼一種與顆粒性甲烷單加氧酶進化相關的CuMMO。我們選擇檢查M.album菌株BG8中pxmA的表達，以確定該基因是否響應與M.denitrificans FJG1類似；M.denitrificans FJG1中pxmABC操縱子的表達響應脫氮條件而顯著增加。

為了評估添加NO2-對基因表達的影響，我們使用在單獨NMS中生長的培養物作為對照。生長24小時后，NMS和NMS+NO2-培養物頂空中的O2濃度分別約為17.2%和16.9%（圖1B）。在添加NO2-的培養物中，pmoA、pxmA、nirS和norB1的轉錄水平在24和48小時時間點顯著高于單獨NMS的培養物（圖5）。在72小時時間點，與單獨NMS培養物相比，NMS+NO2-中pmoA和nirS的轉錄水平仍然顯著升高，而norB1的表達不再顯著升高（圖5）。最有趣的是，在72小時時，pxmA的轉錄本豐度在NMS+NO2-中比在單獨NMS培養物中高19.8倍（圖5）。第二個norB拷貝（norB2）在所有采樣時間點對NO2-添加均無響應（低于兩倍）。