好氧甲烷氧化細菌是一組多樣化的微生物，在自然環境中無處不在。與厭氧甲烷氧化菌和古菌一起，好氧甲烷氧化菌對于減弱甲烷向大氣的排放至關重要。顯然，銨鹽和亞硝酸鹽形式的氮有效性對甲烷氧化菌的活性及其自然群落結構有強烈影響。先前的研究結果表明，添加亞硝酸鹽會抑制某些已培養甲烷氧化菌的活性；然而，允許某些菌株轉化亞硝酸鹽的生理途徑、基因庫存的表達以及支持此活性的電子源在很大程度上仍未得到表征。本文表明，Methylomicrobium album菌株BG8僅在缺氧且存在亞硝酸鹽的情況下，利用甲烷、甲醇、甲醛、甲酸鹽、乙烷、乙醇和氨來支持脫氮活性。我們還證明，推定的脫氮基因nirS和兩個norB基因之一的轉錄本豐度響應亞硝酸鹽而增加。此外，我們發現推定的含銅單加氧酶α亞基編碼基因pxmA的轉錄本豐度響應亞硝酸鹽和缺氧而增加。我們的結果表明，在好氧甲烷氧化菌基因組中廣泛存在的脫氮基因的表達，使得在氧限制下能夠將底物氧化與氮氧化物末端電子受體的還原相耦合。本研究通過揭示在缺氧條件下，多種電子供體支持亞硝酸鹽還原為一氧化二氮，擴展了當前對甲烷氧化菌代謝靈活性的認識。

引言

好氧甲烷氧化細菌在全球碳氮循環之間架起了一座重要的橋梁，這種關系受到全球氮肥使用的影響。氨和硝酸鹽可以通過作為生長和生物量生產的氮源來刺激甲烷氧化菌的活性。此外，一些甲烷氧化菌如Methylomonas denitrificans在缺氧條件下利用硝酸鹽作為呼吸作用的氧化劑。

顯然，好氧甲烷氧化菌中的脫氮作用在氧限制期間起到保存能量的功能。或者，氨和亞硝酸鹽可以作為甲烷氧化細菌的顯著抑制劑。氨是甲烷單加氧酶的競爭性抑制劑，而由能氧化氨生成亞硝酸鹽的甲烷氧化菌產生的亞硝酸鹽是一種具有抑菌特性的毒素，已知能抑制甲烷氧化菌將甲酸鹽氧化為二氧化碳所必需的甲酸脫氫酶。

盡管最近發現好氧甲烷氧化菌能夠進行脫氮作用，但支配MOB中脫氮作用的能量來源、遺傳模塊和環境因素仍然知之甚少。M.denitrificans FJG1利用甲烷作為電子供體呼吸硝酸鹽以保存能量。然而，除甲烷以外的其他C1能源是否可以直接支持脫氮作用尚不清楚。另一種尚未研究的可能性是，C2化合物和無機還原氮源支持甲烷氧化菌的脫氮作用。先前的工作表明，幾種專性甲烷氧化菌，包括Methylomicrobium album菌株BG8，利用顆粒性甲烷單加氧酶和甲醇脫氫酶分別氧化乙烷和乙醇，盡管這兩種底物都不支持生長。氨可能能夠支持甲烷氧化菌的脫氮作用，因為許多好氧甲烷氧化菌能夠將氨氧化成亞硝酸鹽：這一過程由存在含銅單加氧酶酶以及在某些甲烷氧化菌中存在羥胺脫氫酶同系物所促進。利用替代能源支持脫氮作用的能力將增強甲烷氧化菌的代謝靈活性，并使它們能夠在缺乏甲烷和/或氧氣的情況下維持呼吸作用。

Methylomicrobium album菌株BG8是一種屬于γ-變形菌門的好氧甲烷氧化菌；其基因組缺少可溶性甲烷單加氧酶，但包含一個顆粒性甲烷單加氧酶操縱子和一個編碼功能未知的推定性銅單加氧酶的操縱子。該基因組還包含用于銨鹽的導入和同化、硝酸鹽的同化、羥胺氧化為亞硝酸鹽以及推定的脫氮基因模塊——細胞色素cd1型亞硝酸鹽還原酶和兩個拷貝的細胞色素c依賴性一氧化氮還原酶。最近幾個好氧甲烷氧化菌基因組序列的發布，包括M.album菌株BG8，表明推定的亞硝酸鹽和一氧化氮還原酶頻繁存在，而只有三種已培養的甲烷氧化菌擁有呼吸性硝酸鹽還原酶。目前也不清楚缺乏呼吸性硝酸鹽還原酶但擁有異化亞硝酸鹽和一氧化氮還原酶的甲烷氧化菌是否仍然能夠從亞硝酸鹽進行脫氮作用。此外，由于甲烷氧化菌nirS與已知序列存在顯著差異，尚不清楚nirS是否是缺乏nirK的甲烷氧化菌中起作用的亞硝酸鹽還原酶。雖然硝酸鹽呼吸菌M.denitrificans FJG1的基因組編碼了nirS和nirK兩種亞硝酸鹽還原酶，但只有nirK的轉錄水平響應脫氮條件而增加。

本研究的目標是測試多種C1、C2和無機能源是否能直接支持脫氮作用，表征調節M.album菌株BG8中依賴NO2-的N2O產生的環境因素，并評估其推定的脫氮基因庫存的表達。

材料與方法

培養

Methylomicrobium album菌株BG8在含有11 mM KNO3的硝酸鹽礦物鹽培養基或含有10 mM KNO3加1 mM NaNO2的培養基中，于300 mL玻璃Wheaton瓶（配丁基橡膠塞）中培養100 mL。NMS培養基使用磷酸鹽緩沖液調節至pH 6.8。銅的最終濃度為5μM。使用60 mL注射器和0.22μm過濾器/針頭組件，將CH4作為唯一碳源添加到密封瓶中。頂空初始氣體混合比例使用O2氣體調整為CH4:O2=1.6:1。氣密瓶中的初始壓力調整至約1.3大氣壓，以防止在生長過程中因抽取氣體和液體培養樣品而產生真空。培養物在30°C、200 rpm振蕩培養。為了追蹤生長，定期使用帶針頭的注射器取樣（0.5 mL），并通過相位對比顯微鏡使用Petroff-Hausser計數板測定細胞密度。在單獨的日子培養六個生物學重復，并對每個重復收集數據。通過16S rRNA基因測序、相位對比顯微鏡檢查以及在營養瓊脂和TSA上平板培養（無生長表明無污染）來評估培養物純度。我們在開始所有實驗前評估培養物純度，并在每個重復實驗結束時再次評估。

氣體分析

通過使用氣相色譜法對每個培養物的頂空取樣來測定O2、CH4和N2O的濃度。在每個批次培養的0（接種后立即）、6、12、16、20、24、30、36、42、48、60、72、96和120小時對每個重復的頂空取樣。通過將一組未接種的重復瓶在整個實驗期間留置并測量頂空氣體濃度來確定瓶子的氣密性；120小時內泄漏率<1%。使用純氣體O2、CH4和N2O生成標準曲線，用于計算批次培養中的頂空濃度。

瞬時微電極測定

Methylomicrobium album菌株BG8使用上述NMS+NO2-培養基培養72小時。在生長96小時，脫氮活性明顯時，使用過濾歧管將4 x 10^10個細胞收獲到0.2μm過濾器上。將生物質用無菌、無氮礦物鹽培養基洗滌三次。對于圖2和圖4所示數據，將洗滌后的生物質重懸于相同的無氮培養基中，并轉移至配備有OX-MR 氧微電極和N2O-500 氧化亞氮微電極的氣密10 mL微呼吸室中。

對于圖3所示數據，將生物質重懸于添加了100μM NaNO2的礦物鹽培養基中。使用SensorTrace Basic軟件記錄數據。將CH4氣體、0.001%CH3OH、0.01%CH2O、10 mM HCO2H、C2H6氣體、0.01%C2H6O、200 mM NH4Cl和/或1 M NO2-通過氣密注射器直接注入腔室的針頭注射口。在圖3B-E中，分別在添加CH4、CH3OH、CH2O、HCO2H、C2H6、C2H6O之前，將溶解氧降低至<100μmol/L和<25μmol/L，然后啟用數據記錄以限制追蹤時間在100分鐘以內并減少采樣點數量。使用比色法測定NO2-濃度。實驗進行3-4次以證明結果的可重復性，并選擇單個代表性實驗進行展示。