2.5.hMSCs二維成骨培養

單層hMSCs成骨測定時間進程見補充圖1A。第2代培養的hMSCs收獲并以5 x 10?cells/cm2的密度接種在12孔板中，使用α-MEM 15%FBS（D-1）。接種后第二天（D0）加入成骨培養基（α-MEM 20%FBS補充100 nM地塞米松、100μM抗壞血酸和10 mMβ-甘油磷酸酯）±GYY刺激（400-800μM）。培養基和刺激每周更換兩次直至培養D21。在D7、D14、D21進行阿爾新紅S（AR-S）和Von Kossa（VK）染色（Sigma Aldrich）評估礦化的存在和程度。AR-S染色如下進行：細胞在10%甲醛（Kaltek,Padova,Italy）磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中固定15分鐘（RT）后，用40 mM AR-S染色20分鐘，用PBS沖洗兩次。VK如下進行：細胞在1%硝酸銀溶液（Carlo Erba,Milan,Italy）中在UV光下孵育30分鐘，用水沖洗，在5%硫代硫酸鈉（Sigma）中孵育5分鐘。兩種程序結束后，用去離子水沖洗細胞以去除非特異性染色。使用Nikon Instruments Europe BV（Amstelveen,the Netherlands）拍攝AR-S+和VK+染色照片（100倍放大）。

2.6.灌注生物反應器中的hMSCs三維成骨培養

生物反應器中hMSCs成骨測定時間進程見補充圖1B。在U-CUP流動灌注生物反應器系統（Cellec Biotek,Basel,Switzerland）中進行動態培養下的成骨分化。該系統先前已用于通過連續灌注在3D支架中接種細胞，保證均勻分布，有利于營養供應，增強成骨分化和體內骨形成。支架用培養基預處理幾分鐘以提高可操作性，然后置于流動灌注生物反應器系統內。分離并擴增至第2代培養后，將1.5 10?hMSCs重懸于α-MEM 20%FBS中并注入生物反應器（D-1）。應用3ml/min的流速以使細胞在每支架內過夜接種。接種后第二天（D0），加入成骨因子：100 nM地塞米松、100μM抗壞血酸和10 mMβ-甘油磷酸酯（Sigma Aldrich）。因此，在SF_GYY支架中培養的hMSCs在成骨刺激前接受24小時H?S“預處理”。隨后的培養天數，速率降低至0.3 ml/min。D3進行半培養基更換，D7進行第一次全培養基更換；支架在連續灌注下維持最多21天，培養基每周更換兩次。在成骨培養D0、D7或D21收獲構建體。將支架切成兩半，一半用于生物分子分析，另一半用于染色和免疫組化分析或活死分析。

2.7.細胞毒性測定

此實驗在靜態條件下培養24小時進行，以減少研究所需的生物反應器數量。收集上清液，并測量細胞釋放的乳酸脫氫酶（LDH），按照制造商協議如下進行。簡言之，將hMSCs以每支架5 x 103細胞的濃度四重復接種到96孔板中，使用無酚紅的α-MEM 7.5%FBS培養24小時。使用分光光度計（TECAN Infinite®200 PRO;Tecan Italia S.r.l.,Cernusco Sul Naviglio,Italy）在492-620 nm進行LDH比色檢測，細胞毒性計算為與陽性對照（Triton X-100處理的支架；100%細胞毒性）相比的倍數增加。

2.8.細胞活力測定

使用“哺乳動物細胞活/死活力/細胞毒性試劑盒”（Molecular Probes-Invitrogen）進行活/死分析。支架用D-PBS沖洗兩次，然后加入EthD-1（4μM）/Calcein AM（2μM）混合物，在37°C孵育45分鐘。再沖洗兩次后，將支架包埋在最佳切割溫度化合物（OCT compound）中，并在低溫恒溫器中切成5μM切片，方向允許在縱切面切割支架并隨后分析所有層。然后，用DAPI復染，并用抗褪色封片劑（D2522,Sigma Aldrich）封片。使用Eclipse 90i顯微鏡評估Calcein（FITC）、ethidium homodimer-1（EthD-1;TRITC）和DAPI陽性染色。通過NIS軟件（Nikon Instruments Europe BV,Amstelveen,the Netherlands）捕獲高放大倍數（200x）圖像并合并。注意，SF纖維在FITC中發射自發熒光。

2.9.RNA分析

在支架上用RNA pure溶液（Euroclone,Milan,Italy）裂解細胞，使用微量研杵（Sigma Aldrich）破碎構建體。隨后，使用氯仿-酚-乙醇提取方案分離mRNA，并通過DNase I（DNA-free Kit,Ambion,Austin,TX,USA）處理從基因組DNA純化。通過PCR Array（330231 PAHS-026ZR-24,Qiagen,Milan,Italy）分析一組成骨基因的mRNA表達，按照制造商說明。首先使用RT2 PCR array First Strand Kit（Qiagen）從0.6μg mRNA合成cDNA；然后在Rotor Gene Thermal Cycler（Corbett Research,Qiagen）上使用100孔轉子進行擴增，循環和熱條件按制造商建議。CT值低于33的基因視為未表達。

2.10.組織學和免疫組化分析

構建體在4%多聚甲醛（PFA）溶液中固定2小時。樣品以與活/死分析相同的方向石蠟包埋，切成5μm切片并mounted在玻璃載玻片上；然后，它們脫蠟并通過分級乙醇系列洗滌再水化以進行分析。支架內的細胞用蘇木精和伊紅（H&E）（Biocare medical,CA,USA;Riedel de Haen,MA,USA）、AR-S和VK染色（Sigma Aldrich）染色。鑒于蘇木精覆蓋細胞上的AR-S信號，我們未對AR-S切片復染。相反，對于VK染色，細胞進行了復染。對Ki67（Clone MIB-1,M7240,Dako;2.3μg/ml）、堿性磷酸酶（ALP;B4-78,Dshb;0.5μg/ml）、胱硫醚-γ-裂解酶（CSE;H00001491-M01,Abnova;2μg/ml）、血管內皮生長因子A（VEGF A,ab1316,Abcam;10μg/ml）進行再水化切片上的免疫組化。進行了陰性和同型匹配對照。使用Universal AP Detection kit（Biocare Medical,Concord,CA）揭示陽性；細胞用蘇木精復染，經自來水激活，最后用甘油凝膠封片。使用Eclipse 90i顯微鏡評估陽性染色。通過NIS軟件（Nikon Instruments Europe BV,Amstelveen,the Netherlands）捕獲抓圖（100x）和高放大倍數（200x,400x）圖像，用于宏觀或微觀描述陽性。

2.11.對不粘附支架的hMSCs的CFU-F進行AR-S染色

在生物反應器實驗期間偶然發現一群不粘附支架的hMSCs（非粘附hMSCs）。收集這些非粘附hMSCs并進行分析。簡言之，當我們在培養D3更換培養基時，將生物反應器中的“耗盡”培養基轉移到T25培養瓶中。非粘附hMSCs粘附到培養瓶上，并在幾天內形成類似于成纖維細胞集落形成單位（CFU-F）的聚集體。72小時后，進行AR-S如上所述以評估成骨能力。使用Nikon Instruments Europe BV拍攝照片（100倍放大）。

2.12.統計分析

使用GraphPad Prism 6（La Jolla,CA）和SPSS軟件進行統計分析。在LDH數據集和壓縮模量數據集中進行了比較中位數與假設值的Wilcoxon檢驗。在LDH數據集中進行了Kruskall-Wallis檢驗。使用制造商提供的基于網絡的RT2 PCR array Data Analysis工具分析所有分析基因的PCR array數據，并在補充表1和2中顯示為倍數變化。對選定基因組進行了配對樣本的Bootstrap分析：ALP；骨鈣素（BGLAP）；Runt相關轉錄因子2（RUNX-2）；Distal-Less Homeobox 5（DLX5）；骨形態發生蛋白4（BMP4）；骨形態發生蛋白受體1A型（BMPR1A）；骨形態發生蛋白受體2型（BMPR2）；膠原蛋白XV（COLL XV）；整合素亞基Alpha 1（ITGA1）；整合素亞基Alpha 2（ITGA2）；VEGFA；Fms相關酪氨酸激酶1（FLT1）。