摘要

基于硫化氫（H?S）的治療策略在多種生物醫學應用中具有廣闊前景。在觀察到內源性和外源性H?S作為骨合成代謝劑的重要作用后，我們最近開發了一種負載H?S供體GYY4137（GYY）的絲素蛋白（SF）多孔支架，用于骨組織工程應用。本文旨在驗證SF與H?S的結合是否能增強SF的骨傳導性能。通過人骨髓間充質基質細胞進行體外生物相容性和骨合成代謝活性測定。細胞培養在灌注生物反應器中進行以獲得更接近體內微環境的結果。乳酸脫氫酶和活/死實驗排除了細胞毒性。通過蘇木精&伊紅和Von Kossa/阿爾新紅染色分別評估細胞定殖和礦物沉積。通過PCR陣列和免疫組化分析確定相關通路和靶點。研究結果表明：H?S釋放SF支架支持細胞粘附、增殖和存活；此外，H?S激活了參與骨化、成骨細胞分化、骨礦物代謝和血管生成的基因和蛋白，實現了早期高效礦化。基于這些特性，我們建議將H?S釋放SF支架用于骨愈合和再生應用。

1.引言

硫化氫（H?S）是一種內源性氣體遞質，具有廣泛的生理功能，包括抗氧化、抗炎、抗凋亡、細胞保護和促血管生成作用。系統性H?S濃度降低與多種病理狀況相關，表明H?S具有良好的治療潛力。H?S的生理和治療作用已在臨床前研究中廣泛探索，使用了無機硫鹽、合成有機緩釋H?S供體、半胱氨酸類似物、植物源性多硫化物和glucosinolates、核苷硫代磷酸酯以及幾種專門設計用于增強母體藥物在系統性疾病中效力的H?S釋放藥物。

最近發現H?S在生理性骨形成中起主要作用。在絕經后骨質疏松小鼠模型和攜帶突變胱硫醚-β-合酶基因（H?S產生的關鍵酶之一）的小鼠中，H?S生物合成缺陷與骨丟失相關。在這些模型中，使用嗎啉-4-鎓4-甲氧基苯基（嗎啉代）磷二硫代酸酯（GYY4137或GYY）補充H?S血液水平可預防和/或逆轉骨丟失，這主要歸因于H?S介導的成骨分化誘導。值得注意的是，在其他模型（如兔牽張成骨模型）中也發現了外源性GYY給藥對骨形成的類似誘導作用，其中骨丟失與H?S水平降低無關。

在再生醫學中，替換受損骨組織的需求呈指數級增長。牙科、骨科和顱面醫學需要再生由創傷、腫瘤切除、先天缺陷或骨質疏松性骨折引起的骨缺損。

然而，假體手術和自體骨移植作為治療骨缺損的最常用方法存在局限性，并伴有顯著發病率。

新機遇來自用各種生物活性分子功能化骨替代物，旨在增加骨誘導性并支持自愈。用人間充質基質細胞（hMSCs）預接種支架或用成骨生長因子（如重組骨形態發生蛋白）功能化已在骨再生方面取得實質性進展；然而，關于報道的不良反應和向臨床應用的困難轉化引發了安全性擔憂。

最近出現的一種促進各種組織愈合和再生的合適策略是用能夠釋放H?S或增加其原位產生的分子功能化支架。特別是，已開發出H?S釋放水凝膠、納米纖維涂層和微纖維用于心臟再生和真皮傷口再生。該設計背后的策略是為組織微環境提供具有生物活性的H?S濃度，從而促進組織愈合。

報道了兩種提高局部H?S濃度的方法：嵌入H?S供體（N-（苯甲酰硫代）苯甲酰胺衍生物、JK1或二烯丙基二硫化物）或添加能夠催化H?S產生的H?S產生酶（硫代硫酸鹽氰化物硫轉移酶）。

基于H?S對骨細胞的骨合成代謝作用，我們最近開發了一種創新的H?S釋放支架。作為基底生物材料，我們選擇絲素蛋白（SF），這是一種形成絲纖維結構核心的天然蛋白質，具有適用于骨再生應用的生物相容性、機械性能和生物降解率，但其本身在再生骨組織方面不如預接種分化hMSCs的SF支架有效。我們使用鹽浸法制備適合骨組織工程應用的孔隙度，并在制造過程中添加H?S供體以獲得纖維內的精細分散和延長H?S釋放。在H?S供體中，我們選擇GYY基于兩個方面：1）GYY在幾種臨床前體外和體內模型中顯示骨合成代謝活性；2）GYY水溶性并通過水解以緩慢釋放動力學釋放H?S。這是一個重要特征，因為幾種H?S供體的主要缺點之一是突釋現象，導致在微環境中獲得超生理H?S濃度的風險。

在這項體外臨床前研究中，我們旨在研究H?S釋放SF支架與單獨SF相比增強hMSCs成骨分化的能力。我們使用灌注生物反應器中的3D培養模型來接種、擴增和分化hMSCs，并產生基因表達和組織學數據以比較H?S釋放支架與對照SF。

2.材料與方法

2.1.支架制備

本研究使用的支架根據我們先前確定的程序制備，使用由家蠶（Bombyx mori）多雜交蠶生產的蠶繭（購自泰國Chul Thai Silk Co.,Phetchabun）。纖維脫膠、溶解并對水透析以獲得8%（w/v）的單股絲素蛋白水溶液。隨后，使用NaCl作為致孔劑，通過鹽浸法制備多孔支架。將NaCl物理混合到SF溶液中，然后加入GYY4137（Cayman Chemical,Ann Arbor,MI,USA）至最終濃度為1.25%（SF_GYY 1.25%）和5%（SF_GYY 5%），立即在-80°C冷凍并冷凍干燥過夜。產生的支架層方便地打孔獲得小圓柱體（8mm x 4mm），并在使用前使用鈷-60產生的γ射線（25 kGy）滅菌。

2.2.支架的形態和物理表征

評估支架的形態、微觀結構和機械性能。通過掃描電子顯微鏡和共聚焦激光顯微鏡表征SF和SF_GYY的形態。冷凍干燥支架用Pt/Pd濺射涂層，并在二次電子模式下使用場發射掃描電子顯微鏡（FESEM,Zeiss Supra 40,Carl Zeiss,Germany）以4kV加速電壓成像。將濕支架標本浸入1 ml 0.1 mM熒光素染料溶液（Fluorescein-free acid,Sigma-Aldrich,MO,USA）中30分鐘，然后用去離子水沖洗三次以去除多余染料。使用共聚焦激光顯微鏡（Nikon A1,Nikon Instruments,The Netherlands-激發488 nm，發射535 nm）觀察樣品。

在去離子水中浸泡2小時達到水合平衡后，在標準壓縮板中評估水合SF和SF_GYY支架的機械性能。每組分析5個標本。機械測試在室溫（RT）下以2 mm/min的速率在非限制單軸壓縮模式下進行，使用圓柱形標本（直徑6 mm，高度4mm），使用Bose®Electroforce®3200測試儀器（TA Instruments,DE,USA）。從載荷和位移測量計算應力和應變數據。通過擬合初始線性區域的應力-應變曲線確定多孔支架的楊氏模量。

2.3.SF_GYY支架的H?S釋放

使用氣體微安培傳感器H2S-500（Unisense,Aarhus N,Denmark）測量H?S釋放，在孵育介質（PBS 0.01 M，pH 7.4，存在L-半胱氨酸4 mM，RT）中的H?S釋放連續監測12小時，使用硫化物微傳感器連接到作為放大器的萬用表進行數據采集。通過將Na2S*9H2O 0.01 M溶解在充N2的pH 3.6緩沖溶液中獲得校準曲線，記錄的信號（mV）通過軟件轉換為濃度單位。數據減去背景值。

2.4.hMSCs分離

已提出多種人類細胞用于骨再生醫學，此處我們使用骨髓（BM）來源的hMSCs，因為它們是骨駐留細胞，并已在使用水基SF支架前得到驗證。根據我們先前工作中詳述的ficoll密度梯度分離方案，從8名供者的BM抽吸物中分離細胞。BM抽吸物在手術踝關節置換期間從髂嵴獲取，已獲得機構倫理委員會批準和患者知情同意。hMSCs在α-MEM 15%FBS培養基中于37°C、5%CO2和95%O2培養直至達到匯合。α-MEM培養基購自Euroclone（Milan,Italy）；胎牛血清（FBS）澳大利亞來源購自Lonza（Basel,Switzerland）；青霉素/鏈霉素購自Gibco（Life Technologies Italia,Monza MB,Italy）。培養基每周更換兩次。