2.3.實驗程序

2.3.1.實驗容器中的水交換

我們將5升過濾海水放入測試溶液燒瓶中，并通入空氣（對照處理）或氮氣（含有或不含H?S的低氧處理），直到溶解氧濃度分別達到>5 mg/L或<0.5 mg/L（圖2c和d）。

對于每個實驗，通過溶解九水合硫化鈉在測試溶液燒瓶海水中實現三種不同的TS濃度。根據我們初步實驗的結果，暴露實驗中使用的TS濃度范圍設定為：D形幼蟲、殼頂幼蟲和殼頂至完長過渡期幼蟲為3、16和80 mg/L，而完長幼蟲和稚貝則使用更高的TS濃度（32、160和320 mg/L）（表2-4）。然后將燒瓶中的pH用鹽酸或氫氧化鈉調節至7.7，因為該pH水平是在野外觀察到富含硫化物的低氧水上升流期間的pH值。

表2. 24°C水溫下H?S濃度數據

樣本來源	暴露時間(h)	發育階段	實驗期間平均H?S濃度(mg/L)	燒瓶中初始TS濃度(mg/L)
人工受精(AF)	24	D形幼蟲	0.2±0.01	3
			2.0±0.2	16
			10.8±0.7	80
人工受精(AF)	24	殼頂幼蟲	0.3±0.02	3
			1.7±0.1	16
			6.6±0.2	80
人工受精(AF)	24	殼頂至完長過渡期	0.2±0.02	3
			1.1±0.2	16
			6.7±0.1	80
人工受精(AF)	24	完長幼蟲	3.5±0.02	32
			14.0±0.2	160
			28.8±0.8	320
人工受精(AF)	24	稚貝(0.7mm SL)	2.6±0.1	32
			10.9±0.1	160
			21.0±0.3	320
人工受精(AF)	24	稚貝(2.5mm SL)	4.6±0.01	32
			16.2±0.2	160
			32.2±0.4	320
人工受精(AF)	24	稚貝(5.3mm SL)	6.4±0.2	32
			21.2±0.3	160
			42.6±0.9	320
人工受精(AF)	48	稚貝(0.8mm SL)	2.5±0.1	32
			12.6±0.2	160
			25.3±0.4	320
人工受精(AF)	間歇性	稚貝(0.9mm SL)	2.5±0.03	32
			11.9±0.2	160
			24.8±0.3	320
野生種群(WP)	24	稚貝(6.9mm SL)	2.8±0.4	32
			13.5±0.6	160
			26.2±0.7	320
野生種群(WP)	24	稚貝(11.9mm SL)	3.5±0.4	32
			14.9±0.7	160
			30.7±0.3	320
野生種群(WP)	48	稚貝(11.3mm SL)	4.2±0.1	32
			28.1±1.8	160
			52.2±1.4	320

表3. 20°C水溫下H?S濃度數據

樣本來源	發育階段	實驗期間平均H?S濃度(mg/L)	燒瓶中初始TS濃度(mg/L)
人工受精(AF)	殼頂幼蟲	0.3±0.02	3
		1.2±0.02	16
		6.0±0.2	80
人工受精(AF)	殼頂至完長過渡期	0.3±0.02	3
		1.5±0.01	16
		6.7±0.2	80
人工受精(AF)	完長幼蟲	2.6±0.1	32
		12.5±0.5	160
		26.6±0.7	320
人工受精(AF)	稚貝(0.7mm SL)	3.8±0.1	32
		14.3±0.2	160
		29.4±0.6	320
野生種群(WP)	稚貝(6.9mm SL)	2.6±0.4	32
		13.2±0.6	160
		27.3±0.7	320
野生種群(WP)	稚貝(11.9mm SL)	3.0±0.2	32
		15.0±0.8	160
		30.2±0.7	320

表4. 28°C水溫下H?S濃度數據

樣本來源	發育階段	實驗期間平均H?S濃度(mg/L)	燒瓶中初始TS濃度(mg/L)
人工受精(AF)	殼頂幼蟲	0.3±0.01	3
		1.4±0.1	16
		6.3±0.1	80
人工受精(AF)	殼頂至完長過渡期	0.3±0.01	3
		1.4±0.1	16
		6.5±0.2	80
人工受精(AF)	完長幼蟲	3.5±0.04	32
		13.7±0.4	160
		26.9±0.5	320
人工受精(AF)	稚貝(0.7mm SL)	3.3±0.3	32
		15.3±0.1	160
		29.3±0.2	320
野生種群(WP)	稚貝(6.9mm SL)	3.3±0.1	32
		14.3±0.5	160
		27.0±0.9	320
野生種群(WP)	稚貝(11.9mm SL)	3.5±0.4	32
		16.8±0.4	160
		34.4±0.4	320

我們將幼蟲或稚貝放入裝滿常氧海水（DO>5 mg/L）的實驗容器中，然后通過排除氣泡用橡膠塞密封容器的頂部。實驗中使用的幼蟲或稚貝的殼長和數量如表1所示。

然后，我們利用虹吸效應將測試溶液從燒瓶轉移到三個裝有幼蟲或稚貝的常氧海水的密閉實驗容器中，并將常氧水轉移到排水容器中（圖2）。水流速率設定為133 mL/min，水交換在10分鐘內完成。

水交換完成后，使用塑料夾夾住連接實驗容器的管子，停止測試水的流動。然后，幼蟲或稚貝在靜態條件下暴露于測試溶液中，直到實驗結束。

2.3.2.暴露實驗中的H?S濃度、持續時間和溫度

為了揭示菲律賓蛤仔在不同發育階段對H?S耐受性的差異，我們在24°C下使用通過人工授精獲得的幼蟲和稚貝進行了24小時暴露實驗。實驗使用了D形幼蟲、殼頂幼蟲、殼頂至完長過渡期幼蟲、完長幼蟲，以及三種規格的附著稚貝（平均殼長：0.7、2.5和5.3毫米）（表1）。為了研究水溫對菲律賓蛤仔幼蟲和稚貝對H?S和低氧暴露耐受性的影響，我們還在20°C和28°C下使用殼頂幼蟲、殼頂至完長過渡期幼蟲、完長幼蟲以及0.7毫米殼長的小規格稚貝進行了24小時暴露實驗（表3和表4）。此外，我們使用從六條潮灘采集的兩種規格（平均殼長：6.9和11.9毫米；表1）的野生稚貝，在20、24和28°C下進行了24小時實驗，以檢驗野生稚貝對低氧和H?S的耐受性。

為了揭示長時間暴露于低氧和H?S的影響，我們在24°C下使用通過人工授精獲得的稚貝（平均殼長0.8毫米）和從六條潮灘采集的野生稚貝（平均殼長11.3毫米）（表1）進行了48小時暴露實驗。

我們還研究了間歇性暴露于低氧和H?S對通過人工授精獲得的稚貝（平均殼長8.9毫米；表1）的影響。間歇性暴露的時間過程如下：首先暴露于低氧H?S溶液24小時，隨后在常氧海水（DO>5 mg/L）中休息24小時，然后第二次暴露于低氧H?S溶液24小時。在這些實驗中，水溫設定為24°C。

所需的水溫是通過將水交換完成后的實驗容器浸入水浴（體積60升）中實現的，水浴的水溫通過配備恒溫器的溫度控制器進行調節。我們在實驗期間不投喂幼蟲或稚貝。

2.3.3.水質測量

水溫和溶解氧濃度使用光學溶解氧儀測量。我們使用便攜式pH計測量pH。我們通過使用連接到微傳感器萬用表的Unisense H?S微傳感器測量樣品的電壓來估算H?S濃度。根據制造商的協議將樣品電壓轉換為H?S濃度：通過在缺氧和酸性條件（pH<4，此時>99%的溶解硫化物以未電離H?S形式存在）下，一定電壓范圍與已知H?S濃度（用九水合硫化鈉調節）之間進行線性回歸來估算樣品的H?S濃度。

我們測量了水交換開始前燒瓶和實驗容器中溶液的水溫、pH、DO和H?S濃度；水交換剛結束時從實驗容器流出的水（代表用橡膠塞密封的實驗容器內的水質）；以及暴露實驗剛結束時實驗容器（移除橡膠塞后）中的水質。暴露實驗開始和結束之間的平均H?S濃度如表2-4所示。我們通過初步的野外測量觀察到，在東京灣的一個低氧站點（北緯35°33.3'，東經139°54.5'；水深15米），底泥中存在H?S，最大濃度為82.4 mg/kg，使用的是H?S微傳感器。假設沉積物中幾乎全部的H?S都溶入海水中，則實驗室實驗中使用的H?S濃度范圍可能在野外調查觀察到的最大濃度之內。實驗觀察到從開始到結束H?S平均損失22%；這可能是由于實驗容器中微量的氧氣（<0.5 mg/L）對未電離H?S的氧化所致。

2.3.4.生物參數觀察

暴露實驗結束后，我們觀察每個個體的狀態，幼蟲在雙目顯微鏡下觀察，稚貝用肉眼觀察。如果個體表現出足或水管有任何運動，我們則認為其存活。此外，在顯微鏡觀察下，透過其半透明外殼顯示有血液循環的幼蟲被認為存活。

如果稚貝保持其不透明外殼關閉，并且無法確認足或水管的運動，則難以辨別其死活。在這些情況下，我們將個體在24°C常氧條件下的過濾海水中放置24小時；如果其組織部分或完全腐爛或溶解，我們則判定其為死亡。

我們統計每個實驗容器中死亡和存活的個體數量，并計算每個實驗容器的存活率（存活個體數占總使用個體數的百分比）。

2.3.5.統計檢驗

我們使用Tukey-Kramer檢驗來檢驗暴露實驗后幼蟲和稚貝平均存活率在常氧對照與含有或不含H?S的低氧處理之間的差異。所有統計分析均使用計算機軟件R版本3.0.2進行。