摘要

無(wú)處不在的碳酸酐酶(CA)在催化二氧化碳向碳酸氫鹽和質(zhì)子的可逆水合過(guò)程中，在二氧化碳轉(zhuǎn)運(yùn)、酸堿平衡以及將局部酸中毒與血紅蛋白的氧氣卸載聯(lián)系起來(lái)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。考慮到碳酸氫鹽和亞硝酸鹽之間的結(jié)構(gòu)相似性，我們假設(shè)CA使用亞硝酸鹽作為底物來(lái)產(chǎn)生強(qiáng)效血管擴(kuò)張劑一氧化氮(NO)，以增加代謝活躍組織的局部血流量。在這里，我們展示了CA很容易與亞硝酸鹽反應(yīng)生成NO，尤其是在低pH值條件下，而且反應(yīng)中生成的NO能誘導(dǎo)主動(dòng)脈環(huán)的血管擴(kuò)張。這種反應(yīng)發(fā)生在常氧和缺氧條件下，以及CA和亞硝酸鹽處于生理水平的各種組織中。此外，CO2水合作用的兩種特異性抑制劑多佐胺和乙酰唑胺可增加CA催化亞硝酸鹽產(chǎn)生的具有血管活性的NO。這種增強(qiáng)效應(yīng)可能解釋了這些藥物的已知血管擴(kuò)張作用，并表明二氧化碳和亞硝酸鹽與酶活性位點(diǎn)的結(jié)合方式不同。動(dòng)力學(xué)分析表明，pH值較高時(shí)反應(yīng)速率較高，這表明陰離子亞硝酸鹽更有效地參與了催化反應(yīng)。總之，我們的研究結(jié)果揭示了一種新型的CA亞硝酸酐酶酶活性，這種酶活性可將體內(nèi)能量代謝的主要最終產(chǎn)物(CO2/H+)與血管活性NO的生成聯(lián)系起來(lái)。CA介導(dǎo)的NO生成可能對(duì)組織中血流與代謝活動(dòng)之間的相關(guān)性非常重要，例如在大腦活躍區(qū)域就會(huì)出現(xiàn)這種情況。

引言

碳酸歧化酶(CA)是一種含鋅的無(wú)處不在的酶，有多種同工酶，可催化有氧代謝的主要最終產(chǎn)物二氧化碳(CO2)可逆地水合轉(zhuǎn)化為碳酸，形成碳酸氫鹽(HCO3-)和質(zhì)子：

CO2+H2O→H2CO3→HCO3-+H+(1)

CA除了在酸堿平衡和電解質(zhì)平衡中發(fā)揮重要作用外，還能有效地將血液中的氧氣輸送與組織代謝產(chǎn)生的二氧化碳聯(lián)系起來(lái)。作為已知速度最快的酶之一，紅細(xì)胞中的CA能夠在短時(shí)間(0.5秒)內(nèi)使活躍組織毛細(xì)血管中的血液因二氧化碳水化而產(chǎn)生局部pH值下降。這種局部酸中毒會(huì)通過(guò)玻爾效應(yīng)降低血紅蛋白的氧氣親和力，從而在氧氣張力不變的情況下將更多的氧氣卸載到活動(dòng)組織中。

雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多CA抑制劑，但CO2和HCO3-是該酶唯一已知的底物。鑒于亞硝酸鹽和HCO3-之間的高度相似性(具有相同的三叉平面sp2軌道幾何形狀和幾乎相同的各自酸pKa值(分別為3.4和3.5))，并考慮到亞硝酸鹽已知可與CA的活性位點(diǎn)結(jié)合并抑制CO2水合，我們研究了CA使用亞硝酸鹽作為底物生成一氧化氮(NO)這種強(qiáng)效血管擴(kuò)張劑的可能性。

NO合酶(NOS)生成的大部分氮氧化物會(huì)被氧化成亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽在組織中的含量很低。雖然亞硝酸鹽是NO氧化的天然最終產(chǎn)物，但最近的研究表明，亞硝酸鹽也可能是哺乳動(dòng)物組織中NO的重要來(lái)源，尤其是在心血管系統(tǒng)中。目前已發(fā)現(xiàn)幾種含金屬的酶，包括球蛋白、黃嘌呤氧化還原酶和線粒體醛氧化酶，它們可在缺氧或缺氧條件下有效催化亞硝酸鹽一電子還原為NO。雖然低氧水平與亞硝酸鹽在組織中轉(zhuǎn)化為NO之間的復(fù)雜耦合關(guān)系已得到廣泛研究，但能量代謝的最終產(chǎn)物(尤其是質(zhì)子)如何調(diào)節(jié)亞硝酸鹽生成NO的過(guò)程尚未完全明了。早期的研究表明，缺血心臟和主動(dòng)脈血管中的pH值降低導(dǎo)致NO的形成依賴(lài)于亞硝酸鹽。莫丁(Modin)等人在一篇開(kāi)創(chuàng)性論文中首次證明，生理水平的亞硝酸鹽可誘導(dǎo)NO依賴(lài)性主動(dòng)脈血管舒張，尤其是在酸性pH值下，且與NOS活性無(wú)關(guān)。在這一過(guò)程中，亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為NO的化學(xué)(非酶)酸化過(guò)程似乎過(guò)于緩慢，在體內(nèi)亞硝酸鹽濃度通常較低的情況下無(wú)法發(fā)揮主要作用，這表明存在一種特殊的催化劑。在這篇文章中，我們發(fā)現(xiàn)CA能在正常氧氣水平和pH值降低的情況下輕易地從亞硝酸鹽生成高水平的血管活性NO。CA的這一新穎生理特性有助于在氧氣張力低于臨界水平之前調(diào)節(jié)局部血流量，以應(yīng)對(duì)組織代謝活動(dòng)的增加。

材料與方法

材料。多佐胺(Trusopt)來(lái)自默沙東公司。亞硝酸鈉(NaNO2)、亞硝酸鉀(KNO2)、純化的CA(來(lái)自牛紅細(xì)胞，含有CAII異構(gòu)體)、去甲腎上腺素(NE)、乙酰膽堿、不對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸、氯化鋅、吲哚美辛和乙酰唑胺來(lái)自Sigma Aldrich。純化的CA在100℃下加熱變性10分鐘。按上述方法從純化的CA中制備載脂蛋白酶，用Milli-Q(Millipore)水透析，并進(jìn)行脂肪化。經(jīng)丹麥司法部批準(zhǔn)，對(duì)成年雄性Wistar大鼠(10-12wk)實(shí)施斬首和隨后的放血安樂(lè)死。用于化學(xué)發(fā)光的組織立即切除，切成小塊，用冰冷的PBS沖洗血液，勻漿，-80℃保存。從主動(dòng)脈胸腔部分分離出用于微血管肌電圖等長(zhǎng)張力記錄的動(dòng)脈片段，并將其轉(zhuǎn)移到冷生理鹽水(見(jiàn)血管舒張實(shí)驗(yàn))中。

用微型一氧化氮電極測(cè)量NO的產(chǎn)生。使用NO100 NO敏感電極(Unisense)在10mM磷酸鹽緩沖液中測(cè)量NO含量，溫度為37℃，在開(kāi)放室中不斷攪拌。一氧化氮電極的響應(yīng)時(shí)間為10秒。多佐胺、KNO2和CA的應(yīng)用如圖1所示。溶液用毫升Q水配制。用10秒的運(yùn)行平均值對(duì)跡線進(jìn)行平滑處理。在37℃的厭氧磷酸鹽緩沖液中注入飽和氮氧化物氣體(2mM)的厭氧毫微克水，對(duì)電極進(jìn)行校準(zhǔn)。

動(dòng)力學(xué)分析。使用Table Curve 2D軟件對(duì)微型一氧化氮電極獲得的動(dòng)力學(xué)軌跡進(jìn)行非線性最小二乘法擬合分析。

用化學(xué)發(fā)光法測(cè)量NO的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)在一個(gè)裝有10mM磷酸鹽緩沖液和KNO2的反應(yīng)容器中進(jìn)行，該容器經(jīng)過(guò)預(yù)平衡并用N2吹掃，溫度為37℃，使用西弗斯一氧化氮分析儀(NOA 280i)以4s-1的采樣率檢測(cè)氣相中的NO。如圖3所示，應(yīng)用勻漿組織(2mg/ml)、多佐胺(250μM)和CA(10μM)。通過(guò)10秒的運(yùn)行平均值對(duì)蹤跡進(jìn)行平滑處理，獲得的最大值用于進(jìn)一步分析。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用酸化碘化鉀將已知量的亞硝酸鹽完全還原成NO，進(jìn)行校準(zhǔn)。

血管舒張實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)使用微血管肌電圖儀進(jìn)行等張力記錄。如圖4所示，應(yīng)用NE(0.020μM)、NaNO2(10μM)、牛紅細(xì)胞純化CA(10μM)、乙酰唑胺(100μM)和多佐胺(250μM)。PSS含有(以mM為單位)119NaCl、25NaHCO3、4.7KCl、1.18KH2PO4、1.17MgSO4、1.6CaCl2、0.026EDTA和10葡萄糖，用5%CO2-21%O2-74%N2進(jìn)行平衡，并按之前所述進(jìn)行裝片、歸一化和活力控制。所有切片均與不對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸(300μM)和吲哚美辛(3μM)孵育30分鐘，以分別抑制內(nèi)皮NOS和環(huán)氧化酶。在選定的實(shí)驗(yàn)中，主動(dòng)脈節(jié)段與選擇性CA抑制劑乙酰唑胺(100μM)或多佐胺(250μM)單獨(dú)或與1H-[1,2,4]惡二唑并[4,3-a]喹喔啉-1-酮(ODQ，3μM)聯(lián)合孵育30分鐘，以抑制可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶。為誘導(dǎo)動(dòng)脈節(jié)段穩(wěn)定收縮，在1%O2-5%CO2-94%N2條件下平衡5分鐘后，將NE加入肌電圖室。所使用的抑制劑均不影響NE收縮。活性張力定義為加入NE后的收縮水平減去經(jīng)過(guò)歸一化處理后在PSS中平衡30分鐘后的收縮水平。添加CA和亞硝酸鹽后的張力以活性張力的百分比表示。

統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±SE表示，顯著性水平為P＜0.05，其中n代表單個(gè)實(shí)驗(yàn)的次數(shù)。數(shù)據(jù)采用SigmaPlot 11.0軟件(Systat)進(jìn)行非配對(duì)t檢驗(yàn)分析。