囊胚的氨基酸譜分析

含有第7天囊胚的耗盡培養基的氨基酸含量通過反相HPLC測定，如先前描述。細節在材料和方法S1、S2、S3和表S1。

囊胚的氧氣消耗分析

個體囊胚受精后第7天加載到PCR玻璃微管（Drummond）中并允許呼吸30分鐘以形成氧氣梯度。該氧氣梯度使用微呼吸系統（Unisense）實時測量，并使用SensorTrace Pro（Unisense）轉換為氧氣消耗率，根據先前研究。

丙酮酸、乳酸和葡萄糖消耗

第7天囊胚在修改SOF培養基的4μl液滴中單獨培養3小時，alongside空對照液滴。孵育期后，移除胚胎并將耗盡培養液滴冷凍在-80°C直至分析。葡萄糖、乳酸和丙酮酸利用通過耗盡培養基的超熒光測定法測定，如先前描述。

統計分析

所有統計分析均使用SPSS 15.0軟件（Windows系統，美國伊利諾伊州芝加哥市）進行，除非另有說明。采用二元邏輯回歸模型比較三種處理方式下的卵裂率和囊胚率。對于其他參數，采用混合模型方差分析法，將處理方式設為固定因素，重復實驗設為隨機因素，以比較三組間的差異。除氨基酸代謝數據外，其他數據均無需進行方差不等或正態性檢驗的數據轉換。通過卡方檢驗分析囊胚發育階段對氧氣、葡萄糖、丙酮酸及氨基酸譜的影響。相對轉錄本豐度分析采用SigmaStat（Jandel Scientific）軟件包，通過單因素方差分析結合Student Newman-Kleus多重比較法進行事后檢驗。

結果

在升高NEFA存在下成熟卵母細胞的發育能力

在成熟培養基中補充不同NEFA組合對卵裂率無顯著影響，但基于比值比，在升高硬脂酸（HIGH SA）或補充升高硬脂酸（SA）、棕櫚酸（PA）和油酸（OA）濃度組合（HIGH COMBI）的培養基中成熟卵母細胞導致受精后第7天達到囊胚階段的卵母細胞數量顯著減少。HIGH COMBI處理還減少了形成囊胚的卵裂合子數量，與對照組相比。與對照組相比，HIGH SA組中卵裂合子成為囊胚的傾向較低。HIGH SA和HIGH COMBI暴露during maturation對發育能力的影響數據見表1。

由升高NEFA存在下成熟卵母細胞產生的牛囊胚的細胞數量和凋亡細胞指數

HIGH COMBI和HIGH SA組的總囊胚細胞數顯著低于對照組。此外，HIGH SA胚胎的凋亡細胞指數顯著高于對照組和HIGH COMBI胚胎。數據列于表1。

由升高NEFA存在下成熟卵母細胞產生的牛囊胚中關鍵基因的表達模式

我們接下來研究了囊胚中與凋亡、發育、質量和代謝相關的關鍵基因表達。出乎意料的是，許多這些基因的表達模式在由HIGH SA成熟卵母細胞產生的胚胎與對照組之間無差異。然而，這些數據表明DNA甲基化和葡萄糖轉運的調控存在差異；與對照組相比，來自HIGH COMBI條件下成熟卵母細胞的囊胚中DNMT3A和SLC2A1均上調。與對照組相比，在HIGH SA或HIGH COMBI條件下成熟的任一組中，IGF2R基因表達均上調。

來自NEFA暴露卵母細胞的囊胚的氨基酸代謝

如圖2A所示，與對照胚胎相比，來自在所有三種NEFA存在下成熟卵母細胞的囊胚顯示氨基酸消耗、產生和總周轉顯著升高。與對照胚胎相比，HIGH SA胚胎顯示氨基酸消耗和周轉顯著更高。

個別氨基酸的譜圖顯示，與對照和HIGH COMBI胚胎相比，含有來自HIGH SA卵母細胞的囊胚的培養介質中絲氨酸、組氨酸和蘇氨酸的濃度顯著降低，而纈氨酸的消耗由HIGH COMBI囊胚更高。含有來自HIGH SA暴露卵母細胞的囊胚的介質中甘氨酸濃度降低，表明甘氨酸消耗，而對照和HIGH COMBI胚胎顯示凈甘氨酸產生。卡方檢驗顯示處理組間發育階段無顯著差異。因此，發育階段可排除為可能的混淆因素。

來自NEFA暴露卵母細胞的囊胚中ATP生產的關鍵過程

鑒于暴露卵母細胞于升高NEFA影響囊胚質量、基因表達模式和氨基酸代謝的觀察，我們接下來研究了這些胚胎的氧氣消耗。使用非侵入性實時氧氣消耗測定，我們發現來自HIGH COMBI條件下成熟卵母細胞的囊胚消耗的氧氣顯著少于對照胚胎。HIGH SA組與對照組之間或HIGH SA與HIGH COMBI胚胎之間氧氣消耗無顯著差異。我們還測定了來自NEFA存在下成熟卵母細胞的囊胚對丙酮酸、葡萄糖和乳酸的消耗。與對照胚胎相比，HIGH COMBI胚胎消耗的丙酮酸和葡萄糖顯著較少。相比之下，HIGH COMBI胚胎消耗的乳酸顯著多于對照組。HIGH SA與對照胚胎之間丙酮酸、葡萄糖或乳酸消耗水平無顯著差異。卡方檢驗顯示處理組間發育階段無顯著差異。因此，發育階段可排除為可能的混淆因素。