摘要

血清中非酯化脂肪酸（NEFA）濃度升高與肥胖、2型糖尿病等母體疾病相關(guān)，這種現(xiàn)象會(huì)改變卵巢卵泡微環(huán)境，并與因卵母細(xì)胞發(fā)育能力下降導(dǎo)致的不孕癥有關(guān)。本研究以奶牛為模型，探究卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中NEFA濃度升高是否會(huì)影響由此形成的合子發(fā)育和生理功能。將合子培養(yǎng)至囊胚階段后，通過(guò)細(xì)胞數(shù)量、凋亡率、關(guān)鍵基因表達(dá)、氨基酸代謝及氧化代謝等指標(biāo)評(píng)估其質(zhì)量。結(jié)果顯示，在NEFA濃度升高的條件下，卵母細(xì)胞成熟形成的囊胚不僅細(xì)胞數(shù)量顯著減少，凋亡細(xì)胞比例增加，DNMT3A、IGF2R和SLC2A1基因的mRNA豐度也發(fā)生改變。此外，囊胚的氧氣、丙酮酸和葡萄糖消耗量降低，乳酸消耗量上調(diào)，氨基酸代謝水平升高。這些數(shù)據(jù)表明，成熟卵母細(xì)胞暴露于高濃度NEFA不僅會(huì)降低卵母細(xì)胞發(fā)育能力，還會(huì)通過(guò)損害早期胚胎質(zhì)量、存活率和代謝功能，對(duì)生育能力產(chǎn)生負(fù)面影響。

引言

上調(diào)的脂解作用是代謝紊亂如肥胖和II型糖尿病的特征，導(dǎo)致血漿非酯化脂肪酸（NEFA）濃度增加。眾所周知，升高NEFA濃度對(duì)多種細(xì)胞類(lèi)型具有細(xì)胞毒性，如Leydig細(xì)胞、神經(jīng)生長(zhǎng)因子分化細(xì)胞和肝細(xì)胞。此外，胰腺β細(xì)胞暴露于升高NEFA濃度會(huì)損害胰島素分泌，被認(rèn)為是糖尿病發(fā)病機(jī)制中的重要因素。

使用牛模型，我們已證明升高血清NEFA濃度反映在排卵前卵巢濾泡的濾泡液中，并可直接影響顆粒細(xì)胞存活和類(lèi)固醇生成，以及卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。在人類(lèi)中，飽和NEFA如棕櫚酸（PA）和硬脂酸（SA）以時(shí)間和劑量依賴(lài)的方式抑制顆粒細(xì)胞存活，這可能損害生育力。

流行病學(xué)研究表明，與脂解相關(guān)的母體代謝紊亂如肥胖和II型糖尿病是生殖障礙的潛在風(fēng)險(xiǎn)因素，這可能至少部分與早期妊娠丟失有關(guān)。因此，女性肥胖不僅增加流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，還損害輔助生殖技術(shù)的結(jié)局。

廣泛認(rèn)為，適當(dāng)?shù)穆涯讣?xì)胞發(fā)育調(diào)控減數(shù)分裂、受精和早期卵裂的幾個(gè)關(guān)鍵步驟。此外，卵子發(fā)生期間的分子事件影響后續(xù)胚胎基因組的激活，表現(xiàn)在胚胎發(fā)生后期。然而，這些母體代謝紊亂與生育力下降之間的關(guān)系程度尚不清楚。

在本研究中，我們假設(shè)升高NEFA濃度是通過(guò)對(duì)卵母細(xì)胞的負(fù)面影響連接母體代謝紊亂和生育力下降的關(guān)鍵代謝因素。為此，我們使用牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)模型研究牛卵母細(xì)胞成熟期間升高NEFA濃度是否影響后續(xù)胚胎表型。

我們報(bào)告，卵母細(xì)胞成熟期間升高NEFA濃度，特別是油酸（OA）、棕櫚酸（PA）和硬脂酸（SA），對(duì)由此產(chǎn)生的植入前胚胎有負(fù)面后果，在囊胚階段（8天后）測(cè)量。這些包括改變囊胚基因表達(dá)和降低胚胎質(zhì)量，通過(guò)能量和氨基酸代謝（已知的胚胎存活力標(biāo)記）確定。我們的數(shù)據(jù)提供了證據(jù)，表明由于卵母細(xì)胞成熟期間升高NEFA濃度，植入前胚胎出現(xiàn)代謝失調(diào)的機(jī)制，并有助于解釋患有代謝紊亂女性中較高的早期妊娠丟失和流產(chǎn)率。

方法

卵母成熟處理的組成

本研究使用的游離脂肪酸類(lèi)型和濃度基于牛體內(nèi)研究，并且是生理學(xué)適當(dāng)?shù)模驗(yàn)榛加兄庀嚓P(guān)代謝紊亂（包括肥胖）女性中循環(huán)游離脂肪酸濃度與牛在脂解上調(diào)事件中檢測(cè)到的NEFA濃度非常相似。

標(biāo)準(zhǔn)無(wú)血清成熟系統(tǒng)缺乏脂肪酸，盡管卵母細(xì)胞在體內(nèi)成熟的生理環(huán)境含有生理、基礎(chǔ)濃度的NEFA。為了改進(jìn)我們體外模型的相關(guān)性，我們因此使用補(bǔ)充基礎(chǔ)NEFA濃度的成熟培養(yǎng)基作為對(duì)照培養(yǎng)基。我們顯示，在成熟培養(yǎng)基配方中包含生理濃度關(guān)鍵NEFA（三次重復(fù)；595卵母細(xì)胞）不影響發(fā)育能力，與標(biāo)準(zhǔn)無(wú)血清成熟培養(yǎng)基相比。

在初步實(shí)驗(yàn)中，我們確定硬脂酸（SA）為對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力最有毒的NEFA。升高棕櫚酸（PA）濃度對(duì)發(fā)育能力的影響揭示與升高硬脂酸（SA）處理類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)，盡管較不顯著，支持我們先前研究的發(fā)現(xiàn)。升高油酸（OA）處理對(duì)發(fā)育能力無(wú)影響，也不影響總囊胚細(xì)胞數(shù)；僅囊胚凋亡細(xì)胞指數(shù)在OA處理during oocyte maturation后顯著升高。

對(duì)于額外實(shí)驗(yàn)，我們因此聚焦于HIGH SA和HIGH COMBI處理。本研究中使用以下NEFA處理：

1.對(duì)照=生理NEFA濃度（150μM總NEFA，包括25μM SA、50μM PA和75μM OA）。

2.HIGH SA=升高硬脂酸濃度（75μM SA）。

3.HIGH COMBI=升高NEFA濃度組合（425μM總NEFA，包括75μM SA、150μM PA和200μM OA）。

NEFA處理的制備

所有化學(xué)品購(gòu)自Sigma®，除非另有說(shuō)明。SA、PA和OA溶解在純乙醇的儲(chǔ)備溶液中，濃度分別為25、150和200 mM。這些乙醇儲(chǔ)備溶液渦旋混合4分鐘，并在工作溶液中稀釋以獲得成熟培養(yǎng)基中所需最終濃度。無(wú)血清成熟培養(yǎng)基由TCM199組成，補(bǔ)充0.75%無(wú)脂肪酸BSA、0.4 mM谷氨酰胺、0.2 mM丙酮酸鈉、0.1 mM半胱胺、50 ug/mL慶大霉素和鼠表皮生長(zhǎng)因子（mEGF，20 ng/ml）。所有處理劇烈搖動(dòng)45分鐘并在無(wú)菌條件下過(guò)濾滅菌。

體外胚胎生產(chǎn)

體外生產(chǎn)程序如先前描述進(jìn)行，使用屠宰后2小時(shí)內(nèi)收集的母牛檢索的未成熟卵母細(xì)胞。細(xì)節(jié)參考材料和方法S1、S2、S3和表S1。

卵母細(xì)胞發(fā)育能力評(píng)估

卵裂（受精后2天）和囊胚率（受精后7天）定義為成熟卵母細(xì)胞中卵裂合子或形成囊胚的數(shù)量respectively。還記錄了卵裂合子中形成囊胚的數(shù)量。

囊胚細(xì)胞數(shù)量和凋亡細(xì)胞指數(shù)的測(cè)量

細(xì)胞數(shù)量和凋亡細(xì)胞指數(shù)（凋亡細(xì)胞數(shù)over總細(xì)胞數(shù)）通過(guò)用碘化丙啶（PI）和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）染色第7天正常和擴(kuò)張囊胚評(píng)估，如描述。

囊胚RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和mRNA轉(zhuǎn)錄豐度定量

分子生物學(xué)程序如先前描述進(jìn)行。