3.5循環(huán)中硫化氫水平的降低導(dǎo)致缺氧性腦損傷小鼠紅細(xì)胞中2,3-BPG和P50水平的增加


降低循環(huán)硫化氫水平有助于增加缺氧性腦損傷小鼠紅細(xì)胞中的2,3-BPG和P50水平。與先前的缺氧結(jié)果一致。研究顯示，小鼠在缺氧條件下，紅細(xì)胞2,3-BPG水平在一天內(nèi)升高，并在缺氧持續(xù)3天期間保持高水平（圖8(a)）。此外，P50在缺氧一天后增加約15%，并在缺氧第三天繼續(xù)上升（圖8(b)）。我們還檢測了小鼠在缺氧刺激下循環(huán)系統(tǒng)中硫化氫的水平。如圖8(c)所示，缺氧期間循環(huán)系統(tǒng)中的硫化氫水平在第一天顯著降低，并在第三天進(jìn)一步減少。紅細(xì)胞、肝臟和腎臟中的CSE表達(dá)水平在缺氧期間也顯著降低。有趣的是，GYY4137處理逆轉(zhuǎn)了缺氧引起的紅細(xì)胞2,3-BPG和P50水平升高（圖8(d)和8(e)）。隨后，我們測試了缺氧對紅細(xì)胞膜Hb含量、胞質(zhì)BPGM活性以及BPGM從膜到胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，以及缺氧期間硫化氫干預(yù)的效果。如預(yù)期，與正常氧環(huán)境下的小鼠相比，缺氧暴露組小鼠的紅細(xì)胞中血紅素含量顯著升高（圖8(f)）。與此一致的是，缺氧組小鼠紅細(xì)胞的胞質(zhì)BPGM活性顯著增強(qiáng)（圖8(g)），而膜BPGM水平顯著降低，胞質(zhì)BPGM水平則顯著升高（圖8(h)）。在缺氧條件下，GYY4137處理可降低紅細(xì)胞膜血紅素含量，同時(shí)提升胞質(zhì)BPGM活性和膜BPGM水平，降低胞質(zhì)BPGM水平（圖8(f)–8(h)）。此外，缺氧組小鼠的血紅蛋白硫水合水平降低，而GYY4137處理可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象（圖8(i)）。

圖8：硫化氫產(chǎn)量的減少導(dǎo)致小鼠紅細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)的2,3-BPG和P50水平升高，以及BPGM和Hb在膜與細(xì)胞質(zhì)之間的易位。（a–c）缺氧對2,3-BPG、P50和硫化氫水平的影響。野生型小鼠暴露于缺氧（10%氧氣）指定時(shí)間。采集血液樣本以測定紅細(xì)胞2,3-BPG(a)和P50(b)水平，以及血漿中的硫化氫水平(c)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=10）。??p<0.01，????p<0.0001。（d–h）GYY4137對缺氧誘導(dǎo)的2,3-BPG和P50水平升高以及BPGM和Hb從膜到細(xì)胞質(zhì)易位的影響。野生型小鼠暴露于缺氧（10%氧氣）并給予GYY4137或生理鹽水。缺氧和GYY413處理24小時(shí)后，采集血液樣本以測定紅細(xì)胞2,3-BPG(d)、P50(e)、膜血紅素濃度(f)、細(xì)胞質(zhì)BPGM活性(g)以及膜和細(xì)胞質(zhì)BPGM水平(h)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=10）。????p<0.0001。(h)小鼠紅細(xì)胞中Hb的S-硫水合的代表性圖像。野生型小鼠暴露于缺氧（10%氧氣）并給予GYY4137（50 mg/kg）或生理鹽水。缺氧和GYY413處理24小時(shí)后，采集血液樣本以使用生物素開關(guān)技術(shù)測定Hb的S-硫水合。


討論


盡管硫化氫在眾多細(xì)胞和組織中發(fā)揮重要作用，但其在紅細(xì)胞中的功能仍不明確。在本研究中，我們從功能上揭示了硫化氫在控制2,3-BPG生成中起關(guān)鍵作用，并在常氧條件下維持血紅蛋白-氧合血紅蛋白（Hb-O2）親和力在正常范圍內(nèi)。從機(jī)制上，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性硫化氫抑制血紅蛋白向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而在常氧條件下維持BPGM主要錨定于細(xì)胞膜、2,3-BPG水平正常以及Hb-O2結(jié)合親和力。這些研究進(jìn)一步使我們發(fā)現(xiàn)，外周組織中缺氧誘導(dǎo)的硫化氫生成減少導(dǎo)致小鼠紅細(xì)胞2,3-BPG水平升高和Hb-O2結(jié)合親和力降低。綜上所述，我們的發(fā)現(xiàn)揭示了內(nèi)源性硫化氫在紅細(xì)胞中先前未被認(rèn)識的作用，并闡明了硫化氫在常氧和缺氧條件下調(diào)節(jié)2,3-BPG和Hb-O2結(jié)合親和力的分子機(jī)制（圖9）。硫化氫一直被認(rèn)為是重要的氣體信號分子，在健康和疾病中參與多種細(xì)胞和組織功能。

圖9：硫化氫在常氧和缺氧條件下調(diào)節(jié)2,3-BPG和Hb-O2結(jié)合親和力的潛在機(jī)制整合方案。硫化氫抑制Hb從細(xì)胞質(zhì)向膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而促進(jìn)BPGM錨定于膜上，從而防止常氧條件下2,3-BPG水平的升高。在缺氧期間，硫化氫水平的降低促進(jìn)了Hb錨定于膜上，并促使BPGM從膜上釋放到細(xì)胞質(zhì)中，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞中2,3-BPG生成的增加。

關(guān)于硫化氫生成對缺氧刺激的響應(yīng)變化可能存在爭議。一些研究表明，缺氧會促進(jìn)某些組織（如胃腸道組織和頸動(dòng)脈體）中硫化氫的生成，且這些組織中通常可檢測到PO2值和硫化氫濃度；因此，硫化氫被認(rèn)為可以作為氧氣傳感器。相比之下，許多其他研究報(bào)道缺氧會抑制多種組織中硫化氫的生成，并導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)中硫化氫水平下降。D‘Alessandro等人最近報(bào)告稱，高海拔會導(dǎo)致健康志愿者體內(nèi)硫化氫水平立即下降。與此一致的是，我們驗(yàn)證了硫化氫水平顯著在暴露于缺氧環(huán)境的小鼠中，我們發(fā)現(xiàn)其硫化氫水平降低，這與人類在高海拔環(huán)境下的情況相似。通過使用CSE基因修飾的小鼠模型，我們發(fā)現(xiàn)CSE產(chǎn)生的內(nèi)源性硫化氫對2,3-BPG的生成具有持續(xù)抑制作用，并在常氧條件下維持Hb-O2結(jié)合親和力。盡管已有研究表明2,3-BPG和硫化氫在人類高海拔研究中會發(fā)生改變，但硫化氫是否在缺氧條件下調(diào)節(jié)2,3-BPG水平仍不明確。


與CSE缺陷小鼠類似，我們發(fā)現(xiàn)缺氧介導(dǎo)的硫化氫減少會導(dǎo)致2,3-BPG的誘導(dǎo)生成和Hb-O2結(jié)合親和力的降低。因此，我們的研究結(jié)果為紅細(xì)胞生理學(xué)和病理學(xué)提供了重要的新見解，揭示了硫化氫在常氧條件下維持2,3-BPG水平和Hb-O2結(jié)合親和力正常范圍的重要作用，以及硫化氫水平降低在促進(jìn)2,3-BPG生成、從而降低Hb-O2結(jié)合親和力方面的關(guān)鍵作用，這可能是缺氧期間優(yōu)化組織供氧的適應(yīng)性機(jī)制。紅細(xì)胞2,3-BPG的形成受多種信號通路調(diào)控，其水平已知在缺氧條件下被誘導(dǎo)。它可被糖酵解酶的高活性刺激，從而增加葡萄糖被分流至BPGM反應(yīng)。最近，Sun等人研究表明，鞘氨醇-1-磷酸（S1P）可增強(qiáng)GAPDH活性，從而促進(jìn)紅細(xì)胞中2,3-BPG的生成。BPGM是2,3-BPG生成的關(guān)鍵限速酶。


最新研究顯示，在缺氧條件下，腺苷信號通路下游的硫氧還蛋白（AMPK）可激活BPGM。然而，硫化氫如何調(diào)控2,3-BPG生成仍不明確，直到我們證實(shí)了硫化氫在常氧和缺氧條件下對2,3-BPG生成及血紅蛋白-氧結(jié)合的重要性。值得注意的是，血紅蛋白與膜上帶3的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促使磷酸果糖激酶、醛縮酶和GAPDH等糖酵解酶從膜釋放到胞質(zhì)，從而增強(qiáng)糖酵解作用，進(jìn)而促進(jìn)缺氧條件下2,3-BPG的生成。除血紅蛋白和糖酵解酶外，帶4.2、錨蛋白和光譜蛋白等多種蛋白質(zhì)與紅細(xì)胞膜上的帶3相互作用，形成稱為帶3巨復(fù)合體的單一復(fù)合物。據(jù)我們所知，BPGM在紅細(xì)胞中是否介導(dǎo)膜與胞質(zhì)間的轉(zhuǎn)運(yùn)尚未見報(bào)道。通過多學(xué)科生化與遺傳學(xué)方法，我們揭示了由硫化氫介導(dǎo)的BPGM活性及2,3-BPG生成的調(diào)控機(jī)制。


具體而言，通過MS方法，我們從與BPGM相互作用的蛋白質(zhì)中鑒定出4.2號帶蛋白、錨蛋白、光譜蛋白和3號帶蛋白，表明BPGM與紅細(xì)胞膜中的3號帶大復(fù)合體相關(guān)。利用紅細(xì)胞血影膜模型，我們揭示了BPGM在膜與細(xì)胞質(zhì)之間的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，且BPGM與Hb的轉(zhuǎn)運(yùn)相互關(guān)聯(lián)。此外，我們提供了堅(jiān)實(shí)的遺傳學(xué)證據(jù)和藥理學(xué)證據(jù)，證明硫化氫是抑制Hb錨定到膜和BPGM從膜釋放的重要因素，從而維持2,3-BPG水平和Hb-O2結(jié)合親和力的正常范圍。紅細(xì)胞在適應(yīng)低氧環(huán)境方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這與其在氧氣運(yùn)輸和遞送中的重要作用一致。


改善氧氣釋放是成熟紅細(xì)胞適應(yīng)低氧的最重要適應(yīng)之一。然而，對紅細(xì)胞在體內(nèi)適應(yīng)低氧的機(jī)制理解仍不完整。最近的研究表明，紅細(xì)胞鞘氨醇激酶1活性的升高介導(dǎo)的S1P增加是通過誘導(dǎo)氧氣釋放來實(shí)現(xiàn)低氧適應(yīng)的。Liu等人顯示，5′AMP激活的蛋白激酶（AMPK）通過磷酸化和激活2,3-BPG變位酶介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的2,3-BPG生成。在本研究中，我們證明了硫化氫的下調(diào)導(dǎo)致低氧條件下Hb-O2結(jié)合親和力降低，從而揭示了紅細(xì)胞適應(yīng)低氧的新型分子機(jī)制。


本研究的局限性在于，硫化氫調(diào)節(jié)紅細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)之間Hb和BPGM轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。H2S誘導(dǎo)的翻譯后S-硫水合修飾已被證實(shí)對鉀通道和NF-κB等多種蛋白質(zhì)的功能調(diào)控具有重要作用。最近，Zhao等人證明S-硫水合的Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Keap1）和核因子紅系2相關(guān)因子（Nrf2）對硫化氫在應(yīng)對多種損傷刺激時(shí)對肝組織的保護(hù)作用至關(guān)重要。


通過結(jié)合小鼠遺傳學(xué)研究與多種分子生物學(xué)操作，他們提供了Keap1的Cys151在硫化氫處理后發(fā)生硫水合的證據(jù)。盡管我們發(fā)現(xiàn)Hb的α鏈中的Cys104也發(fā)生了硫水合，但其是否對硫化氫調(diào)控Hb-O2親和力具有關(guān)鍵作用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。值得注意的是，Vitvitsky等人報(bào)道血紅蛋白可結(jié)合硫化氫并將其氧化為硫代硫酸鹽和水合多硫化物的混合物。該反應(yīng)是否參與Hb-O2親和力的調(diào)控尚不明確。盡管如此，硫化氫調(diào)控紅細(xì)胞中Hb和BPGM轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制仍需未來研究進(jìn)一步闡明。


結(jié)論


總之，本研究揭示了以下新發(fā)現(xiàn)：硫化氫對于維持正常氧分壓下2,3-BPG水平和Hb-O2結(jié)合親和力的正常范圍至關(guān)重要，而硫化氫的下調(diào)是低氧條件下促進(jìn)2,3-BPG生成的關(guān)鍵信號分子。鑒于所有活細(xì)胞都需要氧氣來適應(yīng)生理和病理應(yīng)激條件下的生存、增殖和分化，硫化氫介導(dǎo)的Hb-O2結(jié)合親和力變化很可能是對各種刺激的重要功能反應(yīng)。