3.結(jié)果與討論

3.1通過(guò)US EPA測(cè)試方法驗(yàn)證抗菌功效

測(cè)試培養(yǎng)物、中和劑溶液和載體均成功通過(guò)了根據(jù)US EPA測(cè)試方法程序指南進(jìn)行的所有無(wú)菌性、存活率、定量和抗菌敏感性對(duì)照。測(cè)試微生物的初始濃度約為10?CFU mL?1（表1），符合US EPA關(guān)于銅合金表面作為消毒劑的功效（方案1）和持續(xù)減少細(xì)菌污染（方案2）的測(cè)試方法。金黃色葡萄球菌ATCC 6538和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）ATCC 33592被銅銀合金涂層有效滅活，與不銹鋼對(duì)照載體相比，在2小時(shí)（方案1）和24小時(shí)間隔內(nèi)的所有時(shí)間點(diǎn)均減少了5個(gè)對(duì)數(shù)，減少百分比大于99.9%（表1）。銅銀合金涂層表面在方案1和方案2中，除2小時(shí)后不銹鋼對(duì)照載體上的水平約為102CFU每載體外，在其他所有時(shí)間點(diǎn)也將產(chǎn)氣腸桿菌ATCC 13048的水平降低了5個(gè)對(duì)數(shù)。然而，與未涂層的不銹鋼表面相比，銅銀合金涂層在方案1和方案2中的減少百分比均大于99.9%（表1）。

在方案1中，銅綠假單胞菌ATCC 15442能夠在銅銀合金涂層表面上存活，幾何平均數(shù)為每載體5.9 CFU，因此與不銹鋼對(duì)照表面（存活銅綠假單胞菌的幾何平均數(shù)為1.1 x 10?CFU每載體）相比，減少百分比為99.9%。然而，在方案2中，從2小時(shí)后的2個(gè)對(duì)數(shù)減少到6、12、18、24小時(shí)后的4個(gè)對(duì)數(shù)減少，減少百分比大于99.9%（表1）。因此，銅銀合金涂層表面成功通過(guò)了測(cè)試方法的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，即在暴露2小時(shí)后減少百分比≥99.9%，在24小時(shí)間隔內(nèi)的所有時(shí)間點(diǎn)減少百分比≥99.0%。

3.2共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）和生物量定量

為了可視化暴露于銅表面后膜受損的細(xì)菌細(xì)胞，活/死染色技術(shù)和熒光顯微鏡是顯而易見(jiàn)的選擇，可以輕松區(qū)分具有完整（綠色熒光）和受損（紅色熒光）膜的細(xì)菌細(xì)胞。然而，觀察到常規(guī)熒光指示劑染料由于銅的光吸收特性，在與金屬銅表面接觸時(shí)會(huì)失去熒光。可以在染色前簡(jiǎn)單地將細(xì)胞從表面移除然后檢查，但這只能允許在設(shè)定的暴露時(shí)間后對(duì)接觸殺滅造成的損傷效應(yīng)進(jìn)行事后可視化，而不能在銅表面進(jìn)行原位跟蹤。

在此，使用改良的活/死染色程序和CLSM，在100分鐘的時(shí)間間隔內(nèi)，將金黃色葡萄球菌8325（圖1）和銅綠假單胞菌PAO1（圖2）細(xì)胞暴露于銅銀合金涂層和未涂層的AISI 316樣品表面并直接觀察。在暴露于銅銀合金涂層表面的最初10分鐘內(nèi)，金黃色葡萄球菌8325死細(xì)胞（紅色）的數(shù)量超過(guò)了活細(xì)胞（綠色）的數(shù)量（圖1和圖3）。25分鐘后，剩余的活細(xì)胞少于20%（圖3a），并且大多數(shù)細(xì)胞在60分鐘后呈現(xiàn)紅色（圖1d）。相比之下，暴露于AISI 316表面的金黃色葡萄球菌8325細(xì)胞保持存活（圖1e-h），并且其百分比在整個(gè)暴露期間大約保持在80%以上（圖3b）。暴露于銅銀合金涂層表面的銅綠假單胞菌PAO1活細(xì)胞數(shù)量從暴露開(kāi)始到60分鐘隨時(shí)間減少（圖2a-d），此時(shí)活細(xì)胞和死細(xì)胞的比例轉(zhuǎn)向后者，死細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始增加（圖3c）。在AISI 316表面上，銅綠假單胞菌PAO1細(xì)胞保持存活（圖2e-h），并且其百分比在100分鐘的暴露期間接近100%（圖3d）。

在金屬表面的直接觀察證實(shí)了銅銀合金涂層表面與未涂層不銹鋼對(duì)照相比的抗菌功效，正如在US EPA方案測(cè)試中也觀察到的那樣。銅銀合金涂層表面對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅速度比對(duì)銅綠假單胞菌更快，并且在US EPA作為消毒劑的功效測(cè)試方法（方案1）中也觀察到銅綠假單胞菌數(shù)量的減少百分比較低。使用US EPA測(cè)試方案測(cè)試的氧化銅浸漬非多孔固體表面，并未在所有測(cè)試中達(dá)到對(duì)銅綠假單胞菌99.9%的減少。因此，這些發(fā)現(xiàn)可能表明銅綠假單胞菌在一定程度上能夠抵抗暴露和接觸銅基表面。在接觸殺滅過(guò)程中，當(dāng)銅因細(xì)菌膜的存在而從銅銀合金涂層表面溶解時(shí)，銅離子會(huì)在那個(gè)有限的空間內(nèi)積累。隨后發(fā)生膜損傷，銅離子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)。革蘭氏陰性菌中存在被周質(zhì)空間隔開(kāi)的兩個(gè)細(xì)胞膜，以及可能在接觸殺滅抑制代謝活動(dòng)之前存在的不同銅穩(wěn)態(tài)機(jī)制，可以解釋觀察到的銅綠假單胞菌殺滅延遲。然而，革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌中的銅穩(wěn)態(tài)機(jī)制尚未完全闡明，并且在界面處檢測(cè)游離銅離子的濃度存在嚴(yán)重的實(shí)際問(wèn)題。

3.3銅銀合金涂層和未涂層表面的pH監(jiān)測(cè)

在金黃色葡萄球菌8325懸浮液層與銅銀合金涂層表面之間的界面附近，pH以約0.14 pH單位/分鐘的速率增加，在20分鐘后達(dá)到pH 9.0以上的平臺(tái)期（圖4）。相比之下，在金黃色葡萄球菌8325懸浮液層與AISI 316表面之間的界面處，pH在10分鐘后從7.5-7.2之間的值下降到7.1-6.7之間的值，速率約為0.03 pH單位/分鐘。20分鐘后，pH達(dá)到7.0-6.5之間的平臺(tái)值（圖4）。這清楚地證明了銅銀合金涂層表面的電化學(xué)活性以及在水界面發(fā)生還原反應(yīng)（O?+2H?O+4e?→4OH?）并產(chǎn)生OH?離子，從而局部升高pH。如果銅銀合金浸入含氯化物的環(huán)境中，則會(huì)建立電偶腐蝕條件。在0.15 M鹽水溶液中，銀和銅的腐蝕電位分別為120 mV和15 mV（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)氫電極）。

因此，在電偶對(duì)中，較貴重的金屬銀以銅的消耗為代價(jià)受到保護(hù)，并且其溶解速率隨合金中銀含量的增加而增加。金黃色葡萄球菌在pH 5.0至7.0范圍內(nèi)的膜電位約為-100 mV（通過(guò)[3H]四苯基鏻TPP?的分布測(cè)量）。因此，在一個(gè)由兩種合金金屬和存在于0.15 M NaCl瓊脂糖基質(zhì)中的金黃色葡萄球菌8325懸浮液組成的三元素系統(tǒng)中，也建立了一個(gè)電偶序列，其中銀具有最高的電化學(xué)電位，其次是銅和細(xì)菌物質(zhì)。因此，有機(jī)物質(zhì)容易氧化，因?yàn)樗哂凶畹偷碾娀瘜W(xué)電位，而金屬合金則成為還原反應(yīng)的場(chǎng)所。銅以其催化活性而聞名，這可能影響了反應(yīng)速率，從而影響了OH?的產(chǎn)生速率。

此外，細(xì)菌生物膜的存在阻止了氧化銅的形成，保持了合金涂層表面的活性，并為氧化還原反應(yīng)以平衡速率進(jìn)行提供了足夠的物質(zhì)，如20分鐘后的平臺(tái)期所示（圖4）。相比之下，未涂層的不銹鋼只是一個(gè)惰性基底，pH的降低可能是未受挑戰(zhàn)的細(xì)菌懸浮液與0.15 M NaCl瓊脂糖基質(zhì)接觸后調(diào)整至最佳pH條件的結(jié)果。如果金黃色葡萄球菌8325懸浮液不存在于瓊脂糖基質(zhì)和銅銀合金涂層表面之間的界面處，pH會(huì)以0.69 pH單位/分鐘的速率從7.0-7.5之間的值（圖5，重復(fù)2和3）增加到4分鐘后的峰值9.5-10.0。在重復(fù)1的情況下（圖5），測(cè)量開(kāi)始時(shí)的pH已經(jīng)是9.0，并在1分鐘后達(dá)到其峰值9.4。然后，pH開(kāi)始以較慢的速率（約0.12 pH單位/分鐘）下降，在20分鐘后達(dá)到8.2-7.6之間的值。當(dāng)在瓊脂糖基質(zhì)和AISI 316表面之間的界面處監(jiān)測(cè)pH時(shí)，它在整個(gè)測(cè)量期間保持在大約6.4-6.7之間的恒定值（圖5）。

一旦0.15 M NaCl瓊脂糖基質(zhì)與銅銀合金涂層表面之間的接觸建立，氧化還原反應(yīng)立即開(kāi)始。在這種雙金屬腐蝕條件下，銀位點(diǎn)上的還原反應(yīng)產(chǎn)生了使pH升高的OH?，同時(shí)銅從合金涂層表面溶解。銅離子隨后與周?chē)h(huán)境反應(yīng)形成氧化亞銅Cu?O。Cu?O的存在然后導(dǎo)致pH下降，因?yàn)樵诮饘俦砻娼⒘诵碌钠胶鈼l件。不銹鋼表面在沒(méi)有細(xì)菌懸浮液層的情況下也是一種電化學(xué)非活性基底，這從界面處測(cè)得的恒定pH值可以明顯看出。

3.4金黃色葡萄球菌8325暴露于pH 7.0至9.5的1 M Tris-HCl緩沖液

由于觀察到銅銀合金涂層表面pH的變化，我們質(zhì)疑這種pH升高是否是快速接觸殺滅的主要原因。因此，我們將初始濃度約為10?CFU mL?1（對(duì)應(yīng)于OD600 2.0）的金黃色葡萄球菌8325暴露于pH 8.0、8.5、9.0和9.5的1 M Tris-HCl緩沖液中，并在25°C下培養(yǎng)1小時(shí)和24小時(shí)。

暴露1小時(shí)后，金黃色葡萄球菌存活水平在10?到10?CFU mL?1之間，并且在24小時(shí)后細(xì)胞水平也保持在10?CFU mL?1以上（表2）。在不同pH下暴露1小時(shí)和24小時(shí)后的存活率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（P>0.01）。暴露24小時(shí)后的1個(gè)對(duì)數(shù)減少是由緩沖條件引起的，無(wú)法與US EPA測(cè)試中接觸殺滅在2小時(shí)后觀察到的4到5個(gè)對(duì)數(shù)減少相比。這表明金黃色葡萄球菌的存活率不受暴露于pH 8.0-9.5范圍的1 M Tris-HCl緩沖液的顯著影響。因此，銅銀合金涂層表面pH的升高不太可能是細(xì)菌減少的主要原因，而更可能在銅銀合金涂層表面的接觸介導(dǎo)殺滅中起次要作用。在環(huán)境條件下，并在界面處存在細(xì)菌生物膜時(shí)，合金中銅和銀的電偶耦合會(huì)誘導(dǎo)氧化還原反應(yīng)。與合金接觸的細(xì)菌細(xì)胞會(huì)氧化，因?yàn)樗鼈兙哂凶畹偷碾娢唬⑶以诮饘傥稽c(diǎn)會(huì)發(fā)生還原反應(yīng)，導(dǎo)致OH?產(chǎn)生和局部pH升高。

結(jié)論

在本研究中，我們證明了銅銀合金涂層在干燥和類(lèi)真實(shí)生活條件下對(duì)細(xì)菌污染的抗菌特性。我們使用了US EPA關(guān)于作為消毒劑的功效和持續(xù)減少細(xì)菌污染的測(cè)試方法，以及通過(guò)CLSM進(jìn)行直接可視化。該合金成功通過(guò)了兩個(gè)EPA測(cè)試方法的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，在暴露2小時(shí)后減少百分比等于（銅綠假單胞菌ATCC 15442）或大于99.9%，并且在24小時(shí)間隔內(nèi)的所有時(shí)間點(diǎn)減少百分比大于99.9%。

在銅銀合金涂層和未涂層表面接觸殺滅的原位監(jiān)測(cè)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌8325生物膜的殺滅速率高于銅綠假單胞菌PAO1。革蘭氏陽(yáng)性活細(xì)胞在暴露的最初幾分鐘內(nèi)顯著減少，而革蘭氏陰性菌的活細(xì)胞和死細(xì)胞比例在暴露60分鐘后轉(zhuǎn)向后者。膜差異和不同的銅穩(wěn)態(tài)機(jī)制可以解釋銅綠假單胞菌PAO1生物膜殺滅速率較慢的原因。

銅銀合金涂層表面的pH測(cè)量和監(jiān)測(cè)顯示，當(dāng)金黃色葡萄球菌8325懸浮液存在于表面和瓊脂糖鹽水基質(zhì)之間的界面處時(shí)，pH快速升高并在20分鐘后達(dá)到pH 9.0的平臺(tái)期。在沒(méi)有細(xì)菌物質(zhì)的情況下，pH迅速升高至約9.5，并由于Cu?O的形成而下降。在未涂層的對(duì)照AISI 316表面未檢測(cè)到pH升高，這是由于缺乏電化學(xué)活性。當(dāng)金黃色葡萄球菌8325懸浮在不同pH（范圍8.0-9.5）的緩沖溶液中時(shí)，未觀察到數(shù)量顯著減少，表明pH不可能是觀察到的抗菌特性的唯一原因。因此，OH?的產(chǎn)生是銅銀合金涂層表面接觸介導(dǎo)殺滅現(xiàn)象的一個(gè)方面，而不是直接原因。在環(huán)境條件下并存在細(xì)菌污染時(shí)，合金中銅和銀的電偶耦合會(huì)誘導(dǎo)氧化還原反應(yīng)：與合金接觸的細(xì)菌細(xì)胞氧化，以及在金屬位點(diǎn)發(fā)生還原，導(dǎo)致局部pH升高。在相同條件下，在未被細(xì)菌細(xì)胞占據(jù)的表面區(qū)域，還原反應(yīng)發(fā)生在銀位點(diǎn)，氧化反應(yīng)發(fā)生在銅位點(diǎn)，導(dǎo)致銅離子釋放。

我們得出結(jié)論，銅銀合金在干燥條件下是一種有效的抗菌劑，可對(duì)抗細(xì)菌污染。合金中金屬的電偶耦合引起的氧化還原反應(yīng)可能在環(huán)境條件下誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞氧化、銅離子釋放和局部pH升高。這三個(gè)因素的結(jié)合是觀察到的該合金涂層抗菌功效的原因，并將確保其在醫(yī)療環(huán)境預(yù)期環(huán)境應(yīng)用中的特性。對(duì)金屬電化學(xué)反應(yīng)性的理解可用于生產(chǎn)其他氧化還原活性金屬的組合，或基于電偶對(duì)的活性系統(tǒng)，根據(jù)特定環(huán)境和應(yīng)用定制元素的選擇。