摘要

阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)會導致睡眠期間間歇性缺氧(IH)。肥胖和OSA都與胰島素抵抗和全身炎癥有關，這可能是組織缺氧造成的。我們假設，缺氧暴露模式決定了外周組織的氧概況和全身代謝結果，而肥胖具有調節作用。將瘦小和肥胖的C57BL6小鼠間歇性缺氧12小時60次/小時(IH60)[吸入氧氣分數(FIO2)21-5%，60/小時]、12次/小時(FIO2-5%，15秒，12/小時)、持續性缺氧(SH；FIO2-10%)或禁食時的常缺氧。測量了肝臟、骨骼肌和附睪脂肪中的組織氧分壓(PtiO2)、血漿瘦素、脂肪連素、胰島素、血糖和脂肪腫瘤壞死因子-a(TNF-a)。在瘦小鼠中，IH60會導致肝臟中的氧波動，而肌肉中的PtiO2波動減弱，脂肪中的PtiO2波動消失。在肥胖小鼠中，肝臟基線PtiO2低于瘦小鼠，而肌肉和脂肪的PtiO2沒有差異。在IH期間，肥胖小鼠和瘦小鼠的PtiO2相似。所有缺氧方案都會導致胰島素抵抗。在瘦小鼠中，缺氧會顯著增加瘦素，尤其是在SH期間(44倍)；IH60(而非SH)會誘導脂肪分泌的TNF-a增加2.5至3倍。肥胖與瘦素和TNF-a的顯著增加有關，而瘦素和TNF-a的增加壓倒了缺氧的影響。總之，IH60導致肝臟和肌肉的氧波動以及脂肪的穩定缺氧。IH和SH會誘發胰島素抵抗，但只有IH60會加重瘦小鼠的炎癥。肥胖會導致嚴重的炎癥，但急性缺氧療法不會加劇炎癥。

引言

間歇性缺氧是阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)的一個明顯特征，被認為是代謝功能障礙發生和發展的一個主要因素。然而，盡管有大量關于代謝和心血管結果的文獻，但人們對間歇性缺氧時組織氧分壓(PtiO2)的變化幾乎一無所知。

大多數OSA患者都很肥胖。肥胖本身會導致胰島素抵抗、2型糖尿病、全身炎癥、氧化應激和不良的心血管后果。脂肪組織缺氧與肥胖導致的胰島素抵抗和全身炎癥有關。肥胖者脂肪組織中的氧含量明顯低于正常體重者。其他胰島素敏感組織(如肝臟和骨骼肌)中的氧含量尚未在肥胖者和瘦弱者中進行比較。

本研究的作者們建立了一種間歇性缺氧小鼠模型，再現了OSA患者夜間的血氧狀況，并證明慢性間歇性缺氧會誘發小鼠的胰島素抵抗、全身炎癥和氧化應激。然而，人們對OSA和間歇性缺氧的多個方面仍然知之甚少。OSA的代謝結果與疾病的嚴重程度相關，但這種關系在動物模型中尚未得到充分研究。在相同的間歇性缺氧頻率下，SpO2(脈搏血氧飽和度測量法測量的血氧飽和度)的最低點越嚴重，肝臟氧化應激和血脂異常越嚴重，但間歇性缺氧頻率對組織氧氣水平和代謝結果的影響尚未在動物模型中進行系統研究。

在本研究中，瘦小鼠和肥胖小鼠暴露于兩種不同的間歇性缺氧方式：12次/小時和60次/小時，以及持續缺氧，并測量了1)血液、肝臟、肌肉和附睪脂肪中的實時氧含量；2)胰島素抵抗指標，包括空腹血糖和血漿胰島素水平，以及影響胰島素抵抗的脂肪因子、瘦素和脂肪連通素的水平；3)氧化應激和炎癥指標。我們選擇了研究人員常用的間歇性和持續性缺氧方案。

我們假設，缺氧暴露方案決定了外周組織的氧概況和全身代謝結果，而肥胖具有調節作用。

方法

實驗動物。研究共使用了143只6至8周大的雄性瘦C57BL/6J小鼠，這些小鼠購自杰克遜實驗室。72只小鼠用于檢測所有報告的代謝變化、氧化應激和炎癥。48只動物用于免疫印跡和缺氧探針的免疫組織染色。23只小鼠僅用于評估動脈血和代謝活躍組織中的氧含量。瘦小鼠食用普通飼料，而肥胖小鼠食用高脂肪飼料(TD03584，5.4千卡/克，脂肪含量35.2%，58.4%的千卡來自脂肪)。小鼠飼養在光-暗調節的環境中，從上午9點到晚上9點為12小時的光照階段。所有測量均在小鼠25-30周齡時進行。

實驗設計。本研究的作者開發了一種小鼠間歇性缺氧模型，如前所述。簡而言之，他們設計了一個氣體控制輸送系統來調節進入籠子的室內空氣、氮氣和氧氣的流量。在間歇性缺氧60次/小時期間，吸入的氧氣分數在30秒內從20.9%降至5%，然后在隨后的30秒內復氧至室內空氣水平，結果每小時發生60次缺氧事件。在每小時12次的間歇性缺氧過程中，吸入的氧氣分數在20秒內從20.9%降至5%，隨后的15秒內保持在5%，然后迅速復氧至室內空氣水平。這種循環每5分鐘重復一次，結果每小時發生12次缺氧事件。在持續的等壓低氧狀態下，吸入氧氣的比例持續降低到10%。正常缺氧小鼠持續暴露于室內空氣中。除評估氧曲線外，所有測量都是將小鼠暴露在常氧、間歇性缺氧12次/小時、間歇性缺氧60次/小時或持續缺氧環境中一個晚上(12小時)，同時禁食。暴露結束前30分鐘，通過尾部放血測量未麻醉小鼠的血糖。暴露結束后，立即用1-2%的異氟醚對小鼠進行麻醉，并獲取血液、肝臟、肌肉和附睪脂肪以進行進一步分析。第二組是11只瘦小鼠和12只肥胖小鼠，它們以前沒有進行過缺氧調節，在不同的缺氧方案中，使用快速反應氧微電極(OX-50，UnisenseA/S，直徑50μm，90%反應時間＜5秒)測量肝臟、肌肉和附睪脂肪中的PtiO2，同時使用小鼠領夾進行無創脈搏血氧測量。根據制造商的協議，在對每只動物進行測量之前和之后都要對氧微電極進行校準。在此過程中，小鼠腹腔注射1.5克/千克尿烷進行麻醉。將小鼠的鼻子從一個孔中放入與第一組小鼠相同的籠子中。然后切開不同組織上的皮膚，以便用探針測量組織含氧量。將氧微電極安裝在微型機械手上，垂直插入距表面2毫米處，然后稍稍回縮至可獲得穩定PtiO2信號的位置。在將氧微電極移動到同一組織的不同位置或不同組織之前，按上述方法進行所有三種缺氧方案和常氧方案的測量，并在同一位置進行記錄。正常缺氧和持續缺氧的測量時間至少為2分鐘，間歇性缺氧的測量時間至少為5分鐘。總體而言，每只實驗動物都進行了多次測量(三種組織的四種實驗方案)。

缺氧探針。缺氧探針的免疫組化染色是根據生產商提供的試劑盒進行的。簡而言之，在組織采集前30分鐘，按60mg/kg體重腹腔注射Hypoxyprobe-1，同時繼續暴露于低氧或常氧環境中。新鮮組織用10%緩沖福爾馬林固定，乙醇脫水，石蠟包埋。使用與FITC結合的Hypoxyprobe-1一抗和與辣根過氧化物酶結合的抗FITC二抗進行免疫組織染色。為了進行Western印跡，將新鮮肝臟、肌肉和附睪脂肪立即冷凍在液氮中。使用Bio-Rad預制凝膠系統進行SDS-PAGE和Western印跡。蛋白質(20μg)用于每個泳道。我們使用Hypoxyprobe-1抗體作為一抗。

生物化學。空腹血漿總膽固醇和甘油三酯、血糖用試劑盒檢測。血漿胰島素和瘦素、脂肪連素使用ELISA試劑盒進行檢測評估。丙二醛用檢測試劑進行測量。為了測量體內腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的分泌，將附睪脂肪組織片段在含有1%BSA的M199培養基中培養3小時。用ELISA試劑盒評估培養基中的TNF-a水平。在進行實時聚合酶鏈反應(PCR)時，使用TRIzol從肝臟中提取總RNA，并使用Advantage RT for PCR試劑盒合成互補DNA。使用特異于TNF-a的引物和探針進行實時逆轉錄酶PCR，如前所述。mRNA表達水平通過標準ΔΔCt方法(http://www.ambion.com/techlib/basics/rtpcr/index.html)與18S核糖體RNA濃度進行歸一化，如我們實驗室之前所做的那樣，然后表示為相關樣本中mRNA與常氧小鼠平均mRNA水平的比值。

數據分析。分析使用Stata 9.0版本進行。數據以均值±SE表示。使用兩樣本Wilcoxon秩和(Mann-Whitney)檢驗比較瘦小鼠和肥胖小鼠的血氧水平。氧水平平均方差的比較采用Wilcoxon符號秩檢驗。在瘦或肥胖表型中，低氧和常氧條件下代謝和炎癥指數的比較采用非配對t檢驗。瘦小鼠和肥胖小鼠之間代謝和炎癥指標的比較采用一般線性模型方差分析。P值小于0.05為差異顯著。