電生理學(xué)。

實(shí)驗(yàn)在VD3055和GE3717動物授權(quán)下進(jìn)行。小鼠被注射戊巴比妥鈉(150毫克/千克)處死后，在正常光照條件下摘取視網(wǎng)膜。眼球摘除后，在含碳氧(95%O2和5%CO2)的培養(yǎng)基中解剖視網(wǎng)膜并轉(zhuǎn)移到顯微鏡臺上進(jìn)行記錄。在使用突觸阻斷劑的實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)基中添加了DL-AP4、DL-AP5、DNQX、卡波諾酮。視網(wǎng)膜模擬視網(wǎng)膜外結(jié)構(gòu)放置，因此RGC面向基底(裸PDMS或假體)。在假體上，視網(wǎng)膜與直徑為80微米、間距為150微米的電極分層排列在陣列中央。記錄在32°C的暗光下進(jìn)行，使用鋒利的金屬電極，放大，濾波(300-3000Hz)，并以30kHz的頻率數(shù)字化。在尼康Ti-E倒置顯微鏡上使用Spectra X系統(tǒng)進(jìn)行照明。顯微鏡配有二向色濾光片和10×物鏡。刺激方案包括在每個輻照度下以1Hz的頻率重復(fù)發(fā)出10個脈沖；輻照度依次增加：LED為0%(0μW mm-2)，2%+ND4(47.38μW mm-2)，3%+ND4(107.91μW mm-2)，2%(189.50μW mm-2)，3%(421.12μW mm-2)，3%(815.92μW mm-2)，5%(1081.75 mW mm-2)、10%(2.81mW mm-2)、20%(5.89mW mm-2)、40%(11.98mW mm-2)、60%(17.92mW mm-2)、80%(23.56mW mm-2)和100%(29.08mW mm-2)。使用基于Matlab的算法通過閾值檢測進(jìn)行尖峰檢測和分類，并在Matlab(Mathworks)中進(jìn)一步處理數(shù)據(jù)。尖峰檢測的閾值定義為背景噪聲標(biāo)準(zhǔn)偏差的3.7倍。同類尖峰之間的最小折射周期設(shè)定為1.4ms。為確保剔除偽影，在光的起始和偏移周圍采用了±1ms的排除期。不過，光照開始(SL)后前10ms內(nèi)的尖峰已經(jīng)過人工驗(yàn)證。計算每種照明條件下的PSTH，將十次重復(fù)刺激中獲得的尖峰光柵離散化并平均到10ms一格。從單個PSTH中對尖峰進(jìn)行分類，并根據(jù)其在光照開始后的時間(補(bǔ)充圖3a中的青色條)將其分為SL組(<10ms)、ML組(40至120ms)和LL組(150至350ms)。三組的發(fā)射率測量方法如下。對于SL峰，使用脈沖后的第一個倉(10ms)。對于ML峰，在規(guī)定的時間范圍內(nèi)使用3個倉(30ms)，以最高倉為中心。對于LL峰，使用規(guī)定時間范圍內(nèi)的5個倉(50ms)，以最高倉為中心。

pH值測量。

實(shí)驗(yàn)在室溫磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。在尼康Ti-E倒置顯微鏡上使用Spectra X系統(tǒng)進(jìn)行照明。顯微鏡配有二向色濾光片和10倍物鏡。用帶內(nèi)部參照物(Unisense)的微電極(尖端直徑為200微米)測量pH值。數(shù)據(jù)采樣頻率為1H。

空間選擇性測量和建模。

在32°C的Ames介質(zhì)中，使用玻璃微移液管(尖端直徑約15μm)測量了電壓分布。數(shù)據(jù)被放大，濾波，并在30kHz進(jìn)行數(shù)字化。在Nikon Ti-E倒置顯微鏡上使用Spectra X系統(tǒng)進(jìn)行照明。顯微鏡配備一個二向色濾光片和一個10×物鏡。采用針孔將光斑直徑限制在150~170μm左右。將光斑對準(zhǔn)POLYRETINA中心區(qū)域的目標(biāo)像素后，以1Hz的頻率發(fā)送10個10ms的脈沖，輻照度為29.07mW mm?2。所得到的電壓已在照明像素周圍三個方向的九個位置測量。數(shù)據(jù)分析在Matlab(Mathworks)中進(jìn)行。檢測到高于噪聲水平(平均噪聲閾值6.2μV)的電壓峰值，其幅度相對于中心像素值歸一化。在COMSOL Multiphysics 5.2中進(jìn)行模擬，并進(jìn)行固定電流研究。鈦陰極置于0.1V，PEDOT：PSS置于0V。地面位于浴室頂部和側(cè)壁，分別距離中心像素2毫米和1毫米(圓柱形幾何)。結(jié)果所示的線形圖是在距離鈦表面20μm處拍攝的。對于每種材料，列出了電導(dǎo)率(Sm?1)和相對介電常數(shù)：鈦(2.6×106/1)，P3HT：PCBM(0.1/3.4)，PEDOT：PSS(30/3)，鹽水(1/80)，PDMS(2×10?14/2.75)。

光學(xué)安全。

光暴露導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷的原因主要有三個：光熱損傷、光化學(xué)損傷和熱聲損傷。第一個與視網(wǎng)膜內(nèi)黑色素吸收光時的視網(wǎng)膜發(fā)熱有關(guān)。第二種發(fā)生在短波長(小于600納米)，曝光時間超過1秒。后者發(fā)生在短脈沖(小于1ns)，并與非線性光力學(xué)效應(yīng)有關(guān)。POLYRETINA功能為10ms綠光脈沖；因此，這一極限可以通過光熱或光化學(xué)損傷來控制。根據(jù)ANSIZ136.1標(biāo)準(zhǔn)，眼科應(yīng)用允許的MPE可以根據(jù)光熱損傷(MPET)的公式(1)和光化學(xué)損傷(MPEC)的公式(2)計算(以W為單位)。這些方程適用于λ=560nm和α=808.12mrad(補(bǔ)充圖1c)。

MPET測量結(jié)果為47.41mW，對應(yīng)于144.22mm2的曝光面積為328.75μW mm?2。MPEC結(jié)果為57.55mW，對應(yīng)399.02μW mm?2。

熱測量。

測量時，熱像儀對準(zhǔn)POLYRETINA假體的上表面。圖像以每秒1幀的速度采集。光脈沖(10ms，20Hz，1.22mW mm-2)由565納米綠色LED發(fā)出，聚焦在樣品水平。

熱建模。

在COMSOL Multiphysics 5.2中使用Bioheat模塊模擬傳熱方程，使用General PDE模塊模擬Beer-Lambert光傳播。照明被建模為直徑為13毫米的均勻光束。眼睛是一個二維軸對稱模型，由多個球體組成，每個球體代表一個域。該模型共定義了角膜、房水、晶狀體、玻璃體、視網(wǎng)膜、RPE、脈絡(luò)膜和鞏膜8個域。將POLYRETINA建模為單一復(fù)合材料，具有PDMS、Pedot：PSS、P3HT：PCBM和鈦的體積平均性質(zhì)。將其簡化為5個具有均勻性質(zhì)的區(qū)域：中心、第一環(huán)、第二環(huán)、不存在鈦的區(qū)域和只有PDMS的區(qū)域。對每個區(qū)域進(jìn)行體積平均，以獲得聚合材料的參數(shù)。為了考慮鈦的不均勻分布，考慮了鈦的分?jǐn)?shù)面積。為了驗(yàn)證聚合模型的參數(shù)，利用POLYRETINA進(jìn)行了連續(xù)光照(560nm，244μW mm?2)的模擬，對應(yīng)于1.22mW mm?2的脈沖光照。假體界面處的熱損失為輻射損失(發(fā)射率=0.9)和對流損失(換熱系數(shù)=38.5Wm?2K?1)。與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，測得的平均透過率為51.67%(圖6為49.07%)，穩(wěn)態(tài)溫升為1.25℃(圖9為1.24℃)。

體外細(xì)胞毒性測試。

研究驗(yàn)證由一家經(jīng)認(rèn)可的公司進(jìn)行。試驗(yàn)根據(jù)ISO 10993-5：ISO 10993-12：試驗(yàn)品制備和參考材料；USP 35-NF 30(87)：生物反應(yīng)性測試，體外；Medistri內(nèi)部程序WI47和WI56。假體在測試前用環(huán)氧乙烷滅菌。提取試驗(yàn)用兩個視網(wǎng)膜假體進(jìn)行，總表面積為3.54平方厘米，產(chǎn)品與提取載體的比例為3cm2ml?1。提取載體為Eagle's Minimum Essential Medium，添加了胎牛血清、青霉素-鏈霉素、兩性霉素B和L-谷氨酰胺。提取過程在37°C下進(jìn)行24小時。將提取物加入含有亞融合L929細(xì)胞單層(1：1稀釋)的一式三份培養(yǎng)孔中。試驗(yàn)樣品和對照組在37°C、5%CO2條件下培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行定量細(xì)胞毒性評價。每孔向細(xì)胞中加入50μl的XTT試劑，然后在37°C、5%CO2條件下再培養(yǎng)3-5小時。

手術(shù)植入。

使用塑料眼球模型和去核豬眼。首先，在距眼球邊緣4毫米處的以下位置將三個23號經(jīng)結(jié)膜瓣膜導(dǎo)管插入眼球：鼻上部、顳上部和顳下部。在眼球上連接平衡鹽溶液輸液器，通過其中一個插管維持恒定的眼壓。然后用15°手術(shù)刀切開一個6.5毫米長的切口。使用特制的鑷子將植入物折疊，然后通過切口插入后腔。進(jìn)入眼球后，松開鑷子，植入物即可展開。然后使用光導(dǎo)管和眼內(nèi)23號鑷子通過另外兩個插管插入植入物，將其操縱并固定在視網(wǎng)膜外構(gòu)型上。