材料與方法

細(xì)菌菌株和生長條件

銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14（Rahme et al.,1995）通常在溶菌肉湯（LB;1%胰蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母提取物）（Bertani,2004）中于37°C、250 rpm振蕩培養(yǎng)，除非另有說明。過夜培養(yǎng)物生長12-16小時(shí)。對(duì)于遺傳操作，菌株通常在含有1.5%瓊脂的固體LB上生長。本研究中使用的菌株列于表1。通常，液體預(yù)培養(yǎng)物用作實(shí)驗(yàn)的接種物。生物學(xué)重復(fù)的過夜預(yù)培養(yǎng)物從劃線瓊脂平板上的單獨(dú)克隆源菌落開始。對(duì)于技術(shù)重復(fù)，單個(gè)預(yù)培養(yǎng)物用作亞培養(yǎng)物的來源接種物。

構(gòu)建銅綠假單胞菌突變株

為了在銅綠假單胞菌PA14（表1）中構(gòu)建無標(biāo)記缺失突變體，使用表2中列出的引物擴(kuò)增目標(biāo)基因兩側(cè)各1 kb的序列，并通過在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）InvSc1中的間隙修復(fù)克隆（gap repair cloning）插入pMQ30（Shanks et al.,2006）。表3中列出的每個(gè)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（Escherichia coli）菌株UQ950中，通過限制性酶切驗(yàn)證，并使用雙親結(jié)合（biparental conjugation）轉(zhuǎn)移到PA14中。在含有100μg/ml慶大霉素的LB瓊脂平板上選擇PA14單交換重組子。在無NaCl并修改為含10%蔗糖的LB上選擇雙交換重組子（無標(biāo)記缺失）。通過PCR確認(rèn)缺失突變體的基因型。組合突變體是通過使用單突變體作為雙親結(jié)合的宿主來構(gòu)建的，除了Dcco1cco2，它是通過同時(shí)將cco1和cco2操縱子作為一個(gè)片段刪除來構(gòu)建的。使用表2中列出的引物L(fēng)D438和LD441擴(kuò)增ccoN4的編碼序列，測序驗(yàn)證后，以相同方式將ccoN4互補(bǔ)回缺失位點(diǎn)。

菌落生物膜形態(tài)分析

過夜預(yù)培養(yǎng)物按1:100稀釋于LB（△N1ΔN2、△N1ΔN2ΔN3、△N1ΔN2△N4、ΔN1ΔN2ΔN4ΔN3、ΔN1ΔN2ΔN4::N4、Δcco1cco2、ΔN1ΔN2Δhcn、ΔN1ΔN2ΔN4△hcn和△cox△cyoAcio按1:50稀釋）并生長至中期指數(shù)相（OD500nm≈0.5）。將10微升亞培養(yǎng)物點(diǎn)種到含有60毫升菌落形態(tài)培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨，1%瓊脂[Teknova(Hollister,CA)A7777]，含40μg/ml剛果紅染料[VWR(Radnor,PA)AAAB24310-14]和20μg/ml考馬斯亮藍(lán)染料[VWR EM-3300]）的10厘米x 10厘米x 1.5厘米方形培養(yǎng)皿（LDP[Wayne,NJ]D210-16）中。對(duì)于生長在吩嗪甲酯硫酸鹽（PMS）上的生物膜制備，在高壓滅菌后向菌落形態(tài)培養(yǎng)基中加入200μM PMS（Amresco[Solon,OH]0361）。對(duì)于硝酸鹽實(shí)驗(yàn)，菌落形態(tài)培養(yǎng)基中加入0、10或40 mM硝酸鉀。平板在25°C、>90%濕度（Percival[Perry,IA]CU-22L）下孵育長達(dá)5天，并使用VHX-1000數(shù)碼顯微鏡（Keyence,Japan）每天成像。顯示的圖像代表了至少10個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用Keyence VR-3100大面積3D測量系統(tǒng)在第5天拍攝生物膜的3D圖像。△cox△cyo△cio、hcn缺失突變體和用于硝酸鹽實(shí)驗(yàn)的菌株使用平板掃描儀（Epson[Japan]E11000XL-GA）成像，代表了至少三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

TTC還原測定

將過夜培養(yǎng)物（五個(gè)生物學(xué)重復(fù)）點(diǎn)種1微升到含有0.001%（w/v）TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑[Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)T8877]）的1%胰蛋白胨、1.5%瓊脂平板上，并在25°C黑暗中孵育24小時(shí)。使用掃描儀（Epson E11000XL-GA）對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行成像，并使用Adobe Photoshop CS5（San Jose,CA）量化TTC還原情況（歸一化至菌落面積）。無色的TTC在還原時(shí)經(jīng)歷不可逆的顏色變化變?yōu)榧t色。

液體培養(yǎng)生長試驗(yàn)

(i)在透明平底聚苯乙烯96孔板(VWR82050-716)中將隔夜前培養(yǎng)物以1:100稀釋(ΔN1ΔN2、ΔN1ΔN2ΔN4和Δcco1cco2以1:50稀釋)，并培養(yǎng)兩小時(shí)(OD500nm"0.2)。然后將這些培養(yǎng)物在新的96孔板中用1%胰蛋白胨稀釋100倍，并在Synergy4平板閱讀器的培養(yǎng)基設(shè)置下于37℃溫度下連續(xù)振蕩培養(yǎng)。在至少24小時(shí)內(nèi)，每隔30分鐘在500納米處讀取一次OD值來評(píng)估生長情況。(ii)hcn突變體：過夜前培養(yǎng)物以1:100稀釋(ΔN1ΔN2Δhcn、ΔN1ΔN2ΔN4Δhcn和Δcco1cco2Δhcn稀釋為1:50)，在MOPS最小培養(yǎng)基(50mM 4-morpholine-propanesulfonic acid(pH7.2)、43mM NaCl、93mM NH4Cl、2.2mM KH2PO4、1mM MgSO4·7H2O、1mg/ml FeSO4·7H2O、20mM六水合琥珀酸鈉)中，培養(yǎng)2.5小時(shí)，直至500納米波長處的OD值=0.1。然后將這些培養(yǎng)物在MOPS極少量培養(yǎng)基中稀釋100倍，置于透明平底聚苯乙烯96孔板中，在37℃溫度下培養(yǎng)，并在平板閱讀器的培養(yǎng)基設(shè)置下持續(xù)振蕩。在至少24小時(shí)內(nèi)，每隔30分鐘在500納米處讀取一次OD值，以評(píng)估生長情況。(iii)終止氧化酶報(bào)告物：過夜前培養(yǎng)物以生物三聯(lián)培養(yǎng)；每個(gè)生物三聯(lián)培養(yǎng)物以技術(shù)二聯(lián)培養(yǎng)。過夜前培養(yǎng)物在1%胰蛋白胨中以1:100稀釋，培養(yǎng)2.5小時(shí)，直到500納米處的OD值為0.1。然后將這些培養(yǎng)物在1%胰蛋白胨中稀釋100倍，裝入透明平底黑色聚苯乙烯96孔板(VWR82050-756)中，在37℃溫度下培養(yǎng)，并在平板閱讀器的培養(yǎng)基設(shè)置下持續(xù)振蕩。在24小時(shí)內(nèi)，每小時(shí)分別在480納米和510納米的激發(fā)波長和發(fā)射波長下讀取熒光值，以評(píng)估GFP的表達(dá)。在24小時(shí)內(nèi)，每隔30分鐘在500納米波長處讀取一次OD值，以評(píng)估生長情況。將技術(shù)復(fù)制的生長和RFU值取平均值，得出每個(gè)生物重復(fù)的相應(yīng)值。沒有在gfp基因上游插入啟動(dòng)子的菌株(MCS-gfp)的RFU值被視為背景值，并從每個(gè)報(bào)告基因的熒光值中減去。