本文作者發(fā)現(xiàn)一個(gè)新現(xiàn)象，感染瘧疾后，傷寒桿菌就容易定殖到腸道。通過現(xiàn)象找機(jī)理，發(fā)現(xiàn)感染瘧原蟲的小鼠胃酸分泌減少，胃pH上升，導(dǎo)致傷感桿菌順利通過胃到達(dá)腸道。并研究了可能得原因是降低了胃中編碼質(zhì)子泵的基因mRNA的豐度。

摘要：

瘧疾寄生蟲感染會(huì)削弱對(duì)腸炎沙門氏菌的定植抗性。傷寒桿菌是腸桿菌科的一員，當(dāng)結(jié)腸微生物群遭到破壞或結(jié)腸粘膜發(fā)炎時(shí)，該菌群的數(shù)量會(huì)增加。然而，我們?cè)谶@里發(fā)現(xiàn)，小鼠感染瘧原蟲會(huì)削弱宿主對(duì)上消化道的控制，從而增強(qiáng)傷寒桿菌的定植。感染了瘧原蟲的小鼠胃pH值升高。在感染傷寒桿菌期間刺激胃酸分泌可恢復(fù)胃酸度和定植抵抗力，這表明寄生蟲誘導(dǎo)的低氯血癥會(huì)增加傷寒桿菌的胃存活率。此外，阻斷瘧原蟲誘導(dǎo)的TNF-α信號(hào)傳導(dǎo)足以防止胃pH值升高，并在同時(shí)感染期間增強(qiáng)傷寒桿菌的定植。總之，這些數(shù)據(jù)表明，通過抑制上消化道的抗菌防御系統(tǒng)（如胃酸），可增加糞便微生物群中兼性厭氧菌（如傷寒桿菌）的數(shù)量。

引言：

腸桿菌目是兼性厭氧細(xì)菌，健康成年人糞便微生物群中常見的少數(shù)物種。糞便微生物群中這一分類群的擴(kuò)大是菌群失調(diào)的標(biāo)志，這與抗生素破壞結(jié)腸微生物群有關(guān)，或與潰瘍性結(jié)腸炎，或結(jié)腸直腸癌患者的結(jié)腸炎癥有關(guān)。腸桿菌科的致病菌，如秋傷寒沙門氏菌、枸櫞酸桿菌或小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，利用其毒力因子引發(fā)結(jié)腸炎，從而改變腸道環(huán)境，增加呼吸電子受體的可用性，促進(jìn)病原體生長，加劇糞便的脫落。小鼠感染瘧原蟲會(huì)引發(fā)腸道炎癥和細(xì)菌菌群失調(diào)，其特點(diǎn)是糞便微生物群中共生腸桿菌增多。一氧化氮在腸腔內(nèi)轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，從而通過硝酸鹽呼吸作用促進(jìn)共生腸桿菌的生長。

我們最近報(bào)告說，感染瘧原蟲會(huì)增加小鼠糞便微生物群中的鼠傷寒桿菌的豐度，這可能是瘧疾患者發(fā)生非傷寒桿菌（NTS）血清型（如鼠傷寒桿菌血清型）侵襲性血流感染風(fēng)險(xiǎn)增加的原因之一。小鼠感染瘧原蟲會(huì)引發(fā)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)以及巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞在盲腸粘膜的炎癥浸潤，但瘧原蟲誘導(dǎo)的腸道炎癥是否會(huì)在合并感染過程中增加傷寒桿菌的糞便脫落仍是未知數(shù)。在這里，我們使用了一種合并感染模型來研究瘧疾增加沙門氏菌腸道定植易感性的潛在相互作用。

材料與方法：

小鼠和合并感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?

感染實(shí)驗(yàn)用的雌性C57BL/6J小鼠（6至8周）購自杰克遜實(shí)驗(yàn)室。為了生成寄生瘧原蟲的血液，CD-1小鼠購自CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室。小鼠在特定的無病原體條件下飼養(yǎng)，8至11周齡時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，每組至少使用五只小鼠，每組使用多籠小鼠（每籠二至五只），以限制籠子效應(yīng)的可能性。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已獲得加州大學(xué)戴維斯分校動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

瘧原蟲感染：

約氏瘧原蟲種群來自瘧疾研究和參考試劑資源庫，并通過CD-1小鼠進(jìn)行維持和擴(kuò)增。通過心臟穿刺采集感染寄生蟲的多只CD-1小鼠的血液，集中后與冷凍溶液以1:2的比例（v/v）混合，儲(chǔ)存在液氮中。模擬感染時(shí)，從未感染的CD-1小鼠身上采集血液，并以類似方法保存。

C57BL/6J小鼠在8至11周齡時(shí)感染約氏瘧原蟲。用0.9%的生理鹽水將寄生蟲血液稀釋至1×108個(gè)寄生蟲感染紅細(xì)胞/毫升。然后用0.1毫升稀釋的寄生蟲血液腹腔接種小鼠。模擬感染時(shí)，用等量生理鹽水稀釋未感染的對(duì)照組血液，然后給小鼠腹腔注射0.1毫升。寄生蟲感染情況通過體重下降、食物消耗、血細(xì)胞計(jì)數(shù)和血液中的寄生蟲負(fù)荷進(jìn)行綜合跟蹤。貧血（循環(huán)血細(xì)胞計(jì)數(shù)減少）和寄生蟲負(fù)荷是通過剪尾收集的血液進(jìn)行評(píng)估的。循環(huán)血細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）以1:1000稀釋尾血，并用TC20自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器評(píng)估細(xì)胞濃度。計(jì)數(shù)與同時(shí)收集和測(cè)量的模擬處理動(dòng)物的平均計(jì)數(shù)進(jìn)行歸一化。寄生蟲血癥是通過檢查Giemsa染色的稀薄血液涂片來確定的，以計(jì)數(shù)含有可檢測(cè)到的約氏瘧原蟲的紅細(xì)胞百分比。

沙門氏菌菌株：

本研究中所用沙門氏菌菌株的完整列表見表S1。除非另有說明，細(xì)菌通常生長在溶菌酶肉湯（LB）瓊脂或麥康凱瓊脂平板上，并在37攝氏度的LB溶液中進(jìn)行有氧培養(yǎng)，同時(shí)酌情添加以下濃度的抗生素進(jìn)行選擇：萘二酸（Nal），0.05毫克/毫升；甲苯西林（Carb），0.1毫克/毫升；卡那霉素（Kan），0.1毫克/毫升；氯霉素（Cm），0.03毫克/毫升。本研究中使用的大多數(shù)突變菌株的構(gòu)建方法已在之前的工作中進(jìn)行了描述。鼠傷寒桿菌invA spiB KanR方法與之前描述的鼠傷寒桿菌invA spiB CmR(FF183)的產(chǎn)生方法相同。傷寒桿菌（GTW58）是經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化FF183后FF183中產(chǎn)生的，并在含有羧苯西林和1mM異丙基-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB中培養(yǎng)維持。

沙門氏菌感染和定植讀數(shù)：

將生長在選擇性瓊脂平板上的鼠傷寒沙門氏菌單菌落接種到添加了適當(dāng)抗生素的LB中進(jìn)行選擇，然后在37°C下振蕩（200rpm）培養(yǎng)14至18小時(shí)。將培養(yǎng)物離心（10分鐘，4000g，4°C）并用不含抗生素的無菌LB沖洗。將離心后的鼠傷寒桿菌重懸于LB中，并調(diào)整至適當(dāng)?shù)募?xì)菌密度，以備感染之用。對(duì)于單一菌株感染，用移液管吸頭將0.02毫升鼠傷寒桿菌口服接種到小鼠體內(nèi)，接種密度約為5×1010菌落總數(shù)（CFU）/毫升。采用這種高劑量接種有助于限制各組小鼠定植的差異，并減少低劑量接種時(shí)可能出現(xiàn)的某些小鼠檢測(cè)不到沙門氏菌的情況，從而更準(zhǔn)確地比較腸道負(fù)擔(dān)。在競(jìng)爭(zhēng)性感染中，分別制備菌株，調(diào)整至1×1010CFU/ml，然后以1:1（v/v）的比例混合，并以0.1ml的量通過口腔灌胃接種。對(duì)接種液進(jìn)行系列稀釋和培養(yǎng)以檢測(cè)CFU，從而確認(rèn)濃度和輸入菌株比率的準(zhǔn)確性，以便計(jì)算競(jìng)爭(zhēng)性感染。鼠傷寒桿菌接種在早上6:00至12:00之間進(jìn)行。小鼠在指定時(shí)間點(diǎn)或奄奄一息時(shí)安樂死。因健康問題提前安樂死的小鼠不在分析之列。

從安樂死小鼠腸道的相關(guān)部分收集腸內(nèi)容物（約20至100毫克），放入1至2毫升的PBS中，渦旋勻漿。然后將樣本在PBS中進(jìn)行連續(xù)稀釋，并將其培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)倪x擇性瓊脂上以評(píng)估CFU量。如果挑戰(zhàn)后未發(fā)現(xiàn)傷寒桿菌，則將載量設(shè)定為用于統(tǒng)計(jì)比較的檢測(cè)限（100CFU/克腸內(nèi)容物）。在持續(xù)4小時(shí)或更短時(shí)間的鼠傷寒桿菌挑戰(zhàn)中，如果小腸中能檢測(cè)到鼠傷寒桿菌，但在盲腸或結(jié)腸內(nèi)容物中未檢測(cè)到CFU，表明在采集時(shí)接種體尚未到達(dá)大腸，則將小鼠排除在分析之外。在這種情況下，使用檢測(cè)限作為盲腸或結(jié)腸中的CFU量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析是不準(zhǔn)確的。在競(jìng)爭(zhēng)性感染中，腸道內(nèi)容物被接種在培養(yǎng)基上選擇接種菌株（LB+納二氧酸）和單獨(dú)的突變菌株（LB+氯霉素）。野生型鼠傷寒沙門氏菌（IR715）負(fù)荷是通過從總數(shù)中減去突變體數(shù)來確定的，競(jìng)爭(zhēng)指數(shù)計(jì)算為野生型：突變體負(fù)荷，并針對(duì)接種物的輸入率進(jìn)行校正。