如圖3(C)所示，氧化石墨烯進入胚胎后，最初出現在胚胎周圍，并選擇性地定位在卵黃囊、心臟、眼睛和尾部；此外，它還富集在血管中。這與氧化石墨烯家族納米材料主要在小鼠的肺、肝和脾臟中積累，并在血管中富集的報告一致。據報道，許多納米粒子都會影響斑馬魚胚胎的早期發育，當胚胎暴露于AgNPs、SiNPs、CNTs和富勒烯時會導致畸形。在本研究中，觀察到了三種典型的畸形，包括心包/卵黃囊水腫、尾部彎曲和眼睛/頭部畸形，這與氧化石墨烯在胚胎中的定位一致。去除絨毛后，在用1mg/L氧化石墨烯處理的胚胎中也觀察到了這三種典型的畸形，這表明氧化石墨烯可在斑馬魚胚胎發育過程中誘導畸形。此外，尾部/脊髓彎曲、心包/卵黃囊水腫和眼/頭畸形的發生率隨氧化石墨烯濃度的增加而增加；心包/卵黃囊水腫的情況尤其如此。然而，如上所述，胚胎中氧化石墨烯的積累并沒有隨著氧化石墨烯濃度的增加而增強。絨毛膜中的氧濃度隨著氧化石墨烯濃度的增加而降低，這表明缺氧增強了氧化石墨烯的毒性。這些結果還表明，缺氧誘發的畸形具有選擇性，通常在心包/卵黃囊(水腫)和頭部觀察到更多的畸形，這可能是因為心臟和大腦比其他器官對缺氧更敏感。有趣的是，尾部/脊髓彎曲的發生率最初隨著氧化石墨烯濃度的增加而增加，后來隨著氧化石墨烯濃度的增加而減少。這些獨特的結果不同于之前用鎘和二氧化鈦納米粒子得出的結果，后者會隨著濃度的增加而持續增強尾部/脊髓彎曲。同樣，與對照組胚胎相比，暴露于1毫克/升氧化石墨烯的胚胎的心率明顯降低；但與對照組胚胎相比，暴露于100毫克/升氧化石墨烯的胚胎的心率卻有所提高。在更嚴重的缺氧壓力下，為了增加氧氣供應，用100毫克/升氧化石墨烯處理的胚胎的心率增加了。納米銀顆粒或納米磷顆粒沒有觀察到這一現象，隨著其濃度的增加，心率會穩步降低。

細胞凋亡被認為是納米材料的一種普遍不良影響，與各種疾病和毒性有關。氧化應激(包括ROS生成)是與氧化石墨烯相關的主要不良效應，被認為是細胞死亡的最可能機制。識別特定器官的細胞凋亡和ROS對于解釋和理解相關疾病或不良反應(如心率異常和畸形)至關重要。在本研究中，ROS和細胞凋亡在氧化石墨烯定位的特定區域都有所增加，這表明氧化石墨烯的積累可能會導致斑馬魚胚胎發育過程中的氧化應激和細胞凋亡。

石墨烯能夠通過激活線粒體途徑誘導產生ROS并隨后引發細胞凋亡，這支持了我們的結果，即細胞凋亡隨著ROS的產生和線粒體的損傷而增加(圖3和圖6)。碳納米管(CNTs)可能會在體內或體外導致ROS生成和毒性效應，這主要是由于表面缺陷的存在。同樣，結構缺陷也被認為在石墨烯系列材料的毒性中起著重要作用，這主要是因為客體原子或分子具有很高的活性。此外，在本研究中觀察到，氧化石墨烯具有鋒利的齒狀邊緣(圖1C)；因此，氧化石墨烯可能會通過直接的物理過程破壞線粒體膜并誘導產生ROS。據報道，這些鋒利的邊緣可直接使細胞、細菌和病毒的膜破裂，從而對生物體造成物理損傷。此外，缺氧環境還可能誘導產生過多的ROS和細胞凋亡，并改變動物和人類胚胎的能量代謝和自我更新。這些結果表明，在胚胎發育過程中產生ROS、導致細胞凋亡和誘發畸形的途徑有很多。然而，ROS的產生與線粒體損傷密切相關，這主要是因為線粒體是斑馬魚胚胎中產生ROS的主要細胞器。

過量產生的ROS明顯抑制了SOD的活性，增加了MDA的含量，造成了氧化應激。先前的研究表明，新生DNA鏈中鳥嘌呤的氧化損傷會抑制DNA甲基化，降低DNA甲基化水平。在本研究中，經1mg/L氧化石墨烯處理的胚胎的DNA整體甲基化水平顯著降低，8-OHdG加合物的水平升高。DNA甲基化水平的降低可能會改變基因表達，從而導致發育異常，如畸形和細胞凋亡。因此，接觸氧化石墨烯引發的異常DNA甲基化模式可能是氧化石墨烯對胚胎產生毒性的潛在機制。濃度為100毫克/升的氧化石墨烯會導致8-HOdG加合物和DNA甲基化水平升高，這意味著氧化石墨烯對胚胎的毒性機制是復雜的。

結論

氧化石墨烯特異性地包裹和滲透絨毛膜，導致絨毛膜缺氧，并在斑馬魚胚胎發育過程中產生毒性。包膜效應直接導致胚胎附近形成明顯缺氧的微環境，氧化石墨烯對絨毛膜表面施加機械力。與此同時，胚胎的自發運動也減弱了，這也與氧化石墨烯的包裹作用有關。這些不利影響最終導致了斑馬魚胚胎發育過程中的孵化延遲。氧化石墨烯可誘導ROS、細胞凋亡、心包/卵黃囊水腫和尾部/脊髓彎曲，其作用與濃度有關。進入胚胎后，氧化石墨烯選擇性地定位于卵黃囊、心臟、眼睛和尾部。氧化石墨烯會破壞線粒體，干擾抗氧化酶的活性，誘導ROS生成和脂質過氧化，并導致這些區域的細胞凋亡和畸形。此外，氧化石墨烯還誘導形成8-OHdG加合物，改變DNA甲基化。這項工作探討了氧化石墨烯對胚胎發育的具體不利影響，并強調了氧化石墨烯對生態和健康的潛在風險。