討論

絨毛膜是一種特殊的生物物質(zhì)，在斑馬魚72hpf之前一直圍繞著胚胎，它可以保護(hù)胚胎并充當(dāng)防止與納米粒子接觸的第一道屏障。我們最近的研究表明，石墨烯基材料可直接與植物細(xì)胞表面的氨基發(fā)生相互作用；但對于絨毛膜來說，這種相互作用尚不明確。在本研究中，我們使用光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和傅立葉變換紅外光譜研究了氧化石墨烯與絨毛膜之間的相互作用。光學(xué)顯微鏡圖像顯示，氧化石墨烯吸附在絨毛和胚胎表面(圖2)。形成的透明氧化石墨烯層覆蓋了突起并包裹了絨毛，導(dǎo)致突起之間的孔道堵塞(圖2B)。胚胎經(jīng)1mg/L氧化石墨烯處理后，絨毛膜上的一些官能團(tuán)發(fā)生了變化，例如，羥基和C=O基團(tuán)的數(shù)量增加了，這表明氧化石墨烯在絨毛膜上的吸附可能是由于羥基之間的相互作用而發(fā)生的。

絨毛膜孔道的堵塞導(dǎo)致絨毛膜與培養(yǎng)基分離，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育。在本研究中，用氧化石墨烯處理的胚胎出現(xiàn)了孵化延遲、心臟功能障礙和畸形。然而，胚胎與環(huán)境隔離所產(chǎn)生的負(fù)面影響尚不明確。因此，我們測量了絨毛膜微環(huán)境的氧濃度和對胚胎的損害。隨著氧化石墨烯濃度的增加，胚胎中逐漸形成了缺氧微環(huán)境，這與絨毛表面的孔被堵塞以及氧化石墨烯對絨毛的包裹程度是一致的(圖2)。氧化石墨烯濃度為1毫克/升時，氣孔未被堵塞，絨毛膜和胚胎附近的氧氣濃度與對照沒有顯著差異(p<0.05)。然而，隨著氧化石墨烯濃度的增加，堵塞程度增加，胚胎附近的氧氣濃度明顯降低(p<0.05)。最后，當(dāng)胚胎暴露于100mg/L氧化石墨烯時，絨毛膜表面被完全包裹，絨毛膜附近區(qū)域和胚胎都明顯缺氧(p<0.05)，這表明氧化石墨烯完全包裹后，胚胎發(fā)育所需的氧氣供應(yīng)不足。

這些數(shù)據(jù)表明，絨毛膜的缺氧程度隨著氧化石墨烯濃度的增加而增加，且呈劑量依賴性(圖2)。此外，去掉絨毛后，含有胚胎和氧化石墨烯的溶液中的氧氣濃度與對照沒有顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明，缺氧微環(huán)境主要是由于絨毛被氧化石墨烯包裹所致。有趣的是，靠近胚胎的絨毛膜中的氧濃度與胚胎在48hpf之前的自發(fā)移動有明顯的正相關(guān)(R2=0.84)，這可能會影響隨后的孵化。

先前的研究報告指出，當(dāng)斑馬魚胚胎暴露于120毫克/升的單壁碳納米管(SWCNTs)和3毫克/升的羥基磷灰石納米顆粒時，會出現(xiàn)孵化延遲。相比之下，單壁碳納米管在100毫克/升的濃度下不會影響斑馬魚胚胎的孵化。這些矛盾可能是由于納米材料的理化性質(zhì)和暴露水平的不同造成的，如它們的化學(xué)成分、純度、尺寸、表面電荷、形狀和結(jié)構(gòu)。在本研究中，使用100mg/L含有0.02%S和0.01%K的高純度氧化石墨烯處理的胚胎出現(xiàn)了孵化延遲。因此，對胚胎發(fā)育的負(fù)面影響主要?dú)w因于氧化石墨烯與生物體之間的相互作用。一般來說，孵化延遲可能是由于絨毛膜的彈性改變、孵化酶受到抑制、缺氧或自發(fā)運(yùn)動減少造成的。氧化石墨烯片可對絨毛膜表面施加機(jī)械力，從而改變絨毛膜的彈性(圖2B)。氧化石墨烯包膜還在絨毛膜中創(chuàng)造了缺氧微環(huán)境(圖2C)，并誘導(dǎo)了孵化延遲。之前的研究表明，與暴露于常氧處理的胚胎相比，暴露于低氧環(huán)境的沙螺(Polinicessordidus)和黑鯛魚(Acanthopagrusbutcheri)胚胎顯示出孵化延遲。此外，與對照組相比，經(jīng)100mg/L氧化石墨烯處理的胚胎在48hpf時的自發(fā)運(yùn)動明顯減少(圖4C)，這是胚胎孵化延遲的另一個原因。此外，氧化石墨烯誘導(dǎo)心包和卵黃囊水腫，這可能干擾了孵化酶的活性(圖4D)。雖然1毫克/升和10毫克/升的氧化石墨烯會誘發(fā)這些畸形，但這些濃度的氧化石墨烯并不影響斑馬魚胚胎的孵化，這表明在本研究中，孵化酶的紊亂并不是導(dǎo)致孵化延遲的決定性因素。

為了檢查氧化石墨烯在胚胎中的遷移情況，使用氧化石墨烯-F進(jìn)行了共聚焦顯微鏡觀察。鑒于氧化石墨烯-F的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于游離的FITC，而且熒光強(qiáng)度隨濃度的增加而線性增加，胚胎中的熒光信號應(yīng)該是由于氧化石墨烯-F的摻入造成的。這一結(jié)果揭示了絨毛膜抵抗氧化石墨烯入侵的能力有限，石蠟切片、TEM和拉曼光譜的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)(圖3B-G)。氧化石墨烯滲透絨毛膜的機(jī)制仍不清楚。之前有報道稱，銀納米粒子(5-46nm)可通過被動擴(kuò)散穿過斑馬魚絨毛膜的孔道。TEM圖像支持上述假設(shè)，即氧化石墨烯自發(fā)地通過被動擴(kuò)散穿透絨毛膜，因?yàn)榻q毛膜是一個無細(xì)胞包膜。然而，與銀納米粒子(NPs)不同的是，氧化石墨烯是通過獨(dú)立的孔道穿透絨毛膜的，如圖3(B)所示。

先前的研究表明，石墨烯或氧化石墨烯主要通過內(nèi)吞作用內(nèi)化到人體細(xì)胞中，并依賴于吸收。在本研究中，用1mg/L氧化石墨烯處理的胚胎中觀察到了含有氧化石墨烯的囊泡(圖3B3)，這支持了上述假設(shè)，表明氧化石墨烯是通過內(nèi)吞作用被斑馬魚胚胎吸收的。在這項(xiàng)研究中，直徑約為101到258nm(平均為147nm)的氧化石墨烯粒子適合被細(xì)胞吸收。然而，隨著氧化石墨烯濃度的增加，氧化石墨烯在胚胎中的積累并沒有增強(qiáng)。這一結(jié)果與Shang等人的報告不一致，他們認(rèn)為石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)以濃度和時間依賴的方式被人類神經(jīng)干細(xì)胞吸收。暴露于高濃度石墨烯量子點(diǎn)的胚胎積累減少，可能是因?yàn)槭┝孔狱c(diǎn)在E3溶液中的穩(wěn)定性降低，聚集性增強(qiáng)，而E3溶液中含有無機(jī)離子(Na+、K+、Mg2+和Ca2+)，阻礙了石墨烯量子點(diǎn)穿透絨毛膜。在這種情況下，絨毛膜有能力抵御高濃度石墨烯的入侵。最近的一項(xiàng)研究通過數(shù)學(xué)建模提出，石墨烯微片是通過邊緣尖角和角落的自發(fā)膜滲透進(jìn)入細(xì)胞的。雖然在這項(xiàng)研究中沒有觀察到氧化石墨烯直接自發(fā)的膜穿透，但如圖3(B1)所示，氧化石墨烯穿透絨毛膜進(jìn)入胚胎的模式是可能的。