追蹤氧化石墨烯的異位

氧化石墨烯(10mL，100mg/mL)和異硫氰酸熒光素(FITC)(100mL，1mg/mL)在超聲下混合10分鐘。用透析膜過濾FITC標(biāo)記的氧化石墨烯(氧化石墨烯-F)溶液，去除游離的FITC。最后，通過激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)對受精后24小時(hpf)胚胎中的氧化石墨烯-F運(yùn)輸進(jìn)行實時監(jiān)測。

有關(guān)分析方法的詳細(xì)信息見補(bǔ)充材料。為了確認(rèn)氧化石墨烯在胚胎中的轉(zhuǎn)移和分布，我們制作了石蠟切片和超薄切片，并分別使用光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡(TEM)進(jìn)行了顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)觀察。有關(guān)分析方法的詳細(xì)信息見補(bǔ)充材料。為了確定胚胎中的氧化石墨烯沉積物，使用514nm激光(DXR顯微鏡)記錄了拉曼光譜。

死亡率、孵化、心率、自發(fā)運(yùn)動和畸形

每天對胚胎進(jìn)行分析，記錄存活率、形態(tài)和毒性終點(diǎn)的變化。每24小時更換一次E3溶液(200mL)，直至96hpf。通過光學(xué)顯微鏡檢查胚胎或幼魚的運(yùn)動、心跳和血液循環(huán)，確定其死亡率，并每天記錄結(jié)果。在48hpf，記錄胚胎的心跳和自發(fā)運(yùn)動。72和96hpf時，分別記錄胚胎孵化和是否出現(xiàn)身體異常。每個實驗均一式三份。分析方法詳見補(bǔ)充材料。

細(xì)胞凋亡、ROS和氧化應(yīng)激的測量

根據(jù)Cheng等人之前描述的方法，對發(fā)育超過96hpf的斑馬魚胚胎的凋亡率進(jìn)行了量化。

使用熒光顯微鏡觀察熒光。分析方法詳見補(bǔ)充材料。

根據(jù)上述實驗，觀察了暴露于1mg/L氧化石墨烯的胚胎，并注意到特定區(qū)域的胚胎凋亡和ROS生成。使用TU-1901分光光度計測量超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，如前所述。

遺傳毒性

使用DNeasy血液和組織試劑盒從發(fā)育超過96hpf的胚胎中分離出基因組DNA，具體操作方法請參閱生產(chǎn)商提供的說明書。斑馬魚體內(nèi)8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-OHdG)的濃度通過酶聯(lián)免疫吸附法測定，具體方法見補(bǔ)充材料。使用2504.6-mmHypercloneC18色譜柱，通過高效液相色譜法(HPLC)測定DNA甲基化。全局DNA甲基化的百分比根據(jù)Ramsahoye方法進(jìn)行量化。

統(tǒng)計分析

為了量化胚胎中的氧化石墨烯，使用ImageJ軟件對TEM圖像中觀察到的氧化石墨烯聚集進(jìn)行量化。相對熒光強(qiáng)度使用奧林巴斯FV-10ASW3.1軟件進(jìn)行量化。所有統(tǒng)計分析均使用IBMSPSS22.0統(tǒng)計軟件。除非另有說明，每個實驗至少一式三份。使用Levene中位數(shù)檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行同方差分析，并采用單因素方差分析來確定與暴露條件和處理相關(guān)的效應(yīng)。鄧尼特檢驗用于成對多重比較。所有分析的顯著性水平均為p<0.05。

結(jié)果

氧化石墨烯特性

圖1、氧化石墨烯的特征。(A)溶解在超純水和E3溶液中的氧化石墨烯的Zeta電位。數(shù)據(jù)點(diǎn)對應(yīng)的是平均值(兩個重復(fù)；每個重復(fù)測量6次)。(B和C)顯示氧化石墨烯厚度和直徑的原子力顯微鏡圖像；(C)箭頭表示氧化石墨烯表面的缺陷。(D)TEM圖像。(E)SEM圖像。(F)使用ZETAPALS/BI-200SM儀器測量的氧化石墨烯大小。(G)氧化石墨烯的傅立葉變換紅外光譜。AFM：原子力顯微鏡；TEM：透射電子顯微鏡；SEM：掃描電子顯微鏡；FT-IR：傅立葉變換紅外光譜。

本研究詳細(xì)考察了E3溶液中氧化石墨烯的特性。我們在230納米波長處檢測到一個峰值，在大約280納米波長至300納米波長處檢測到一個峰肩，這與氧化石墨烯的典型紫外吸收光譜相符。然而，在超純水中，氧化石墨烯的zeta電位為-30.5mV，而在E3溶液中則升至-20.1mV(圖1A)。TEM和SEM圖像顯示了氧化石墨烯納米片的不規(guī)則褶皺，這反映了氧化石墨烯的柔韌性(圖1D和E)。原子力顯微鏡成像顯示，氧化石墨烯納米片的厚度約為0.8-1納米(圖1B和C)，直徑約為101-258納米(以147納米為中心)，這是通過廣角光散射測量的(圖1F)。氧化石墨烯的傅立葉變換紅外光譜清楚地顯示了-OH(~3340cm-1)、C=O(~1720cm-1)、C=C(~1620cm-1)、C-OH(~1400cm-1)和C-O-C(~1070cm-1)官能團(tuán)的存在(圖1G)。上述結(jié)果驗證了所使用的納米材料是典型的氧化石墨烯。此外，EDX圖像按原子百分比記錄了86.44%的C、12.74%的O、0.02%的S、0.01%的K和0.79%的Cu(主要由銅網(wǎng)格貢獻(xiàn))。

氧化石墨烯最初包裹絨毛膜，誘發(fā)缺氧微環(huán)境

圖2(A)中的光學(xué)顯微鏡圖像顯示，未接觸氧化石墨烯的對照組斑馬魚胚胎是透明的。然而，在暴露于氧化石墨烯的胚胎中，絨毛膜外出現(xiàn)了黃色的氧化石墨烯沉積物，這表明氧化石墨烯吸附在絨毛膜上。這一現(xiàn)象在幼魚的光學(xué)圖像上得到了證實，在胚胎暴露于氧化石墨烯后，幼魚的光學(xué)圖像上顯示出許多深黃色的薄片(氧化石墨烯)附著物。掃描電鏡顯示，胚胎絨毛膜外層覆蓋著大小不一的突起物。此外，掃描電子顯微鏡證實氧化石墨烯覆蓋了絨毛膜(圖2B)。絨毛膜被氧化石墨烯包覆會改變絨毛膜的官能團(tuán)，例如胚胎暴露于1mg/L氧化石墨烯后，絨毛膜中的C-OH(1400cm-1)增加，C=O(~1700cm-1)減少。

圖2、絨毛膜被氧化石墨烯包覆會導(dǎo)致胚胎缺氧。24hpf后斑馬魚胚胎的光學(xué)顯微鏡(A)和掃描電鏡(B)圖像。絨毛膜250微米深處的氧氣濃度(A中的紅色標(biāo)簽)。紅色箭頭表示SEM圖像中絨毛表面的氧化石墨烯聚集體。(C)48hpf時，使用氧氣微電極檢測絨毛0至250毫米深處的氧氣濃度。黑色矩形表示絨毛膜中的氧濃度與對照組相比有顯著差異。

在對照樣本中，絨毛膜附近的氧氣濃度為271毫摩爾，當(dāng)微電極插入胚胎250毫米深處時，絨毛膜空間的氧氣濃度逐漸下降到264毫摩爾(圖2C)。對于暴露于1、10和100毫克/升氧化石墨烯的胚胎，在250毫米的深度，氧氣濃度分別變?yōu)?44、243和227毫摩爾，與對照組相比顯著下降(p<0.05)(圖2C)。此外，用氧化石墨烯處理的脫絨毛胚胎與對照組的氧氣濃度沒有明顯差異。這些數(shù)據(jù)表明，氧化石墨烯的包被會導(dǎo)致胚胎缺氧。