結果：

1.溶液中的H2濃度

圖1 H2溶解生理鹽水的制備和H2濃度的測量A：將生理鹽水袋放入丙烯酸真空室，其中的空氣被100%的H2氣體取代；B：30分鐘內生理鹽水袋中和輸液管出口處的H2濃度。全線表示鹽水袋中的H2濃度，斷線表示輸液管出口處的H2濃度。

在丙烯酸真空室中暴露于100%的H2氣體24小時后（圖1A），生理鹽水袋中的H2溶解濃度為87.2%。換句話說，H2氣體很容易穿透塑料袋，溶液在24小時內幾乎與環境中的H2氣體達到平衡。然而，從試驗室取出后，袋中的H2濃度在30分鐘內降至61.2%（圖1B）。在持續灌流（10毫升/分鐘）的情況下，輸液管出口處的H2濃度最初為53.8%，但在30分鐘內降至47.2%（圖1B）。

2.H2對組織損傷的影響

圖2：A：通過HE染色的角膜切片研究H2治療的組織學影響；B：第7天H2組和生理鹽水組眼球前節攝影的比較。

HE染色顯示第1天角膜緣有各種炎癥細胞。雖然這些細胞在第7天明顯浸潤了生理鹽水組的角膜中心，但這種變化在H2組明顯很?。▓D2A）。同樣，前段攝影顯示，生理鹽水組在第7天出現嚴重的紅斑和角膜翳，而H2組的變化極小（圖2B）。

3.H2對角膜新生血管的影響

圖3評估角膜新生血管對H2治療的反應A：免疫組化評估第7天角膜中心JG12陽性的血管內皮細胞（箭頭）；B：H2治療顯著減少了角膜中心的毛細血管管腔。

血管內皮細胞特異性JG12染色用于評估新生血管（圖3A）。具體來說，通過計數顯微鏡視野中標記的毛細血管腔來評估新生血管的程度。與生理鹽水組相比，H2組的新生血管在第7天被抑制了約60%（圖3B）。

4.H2對炎癥細胞的影響

圖4 H2處理對自由基和中性粒細胞浸潤的影響A：各時間點用生理鹽水或H2處理的EST染色（箭頭）損傷角膜的代表性圖像。同時還顯示了免疫染色序列切片分析中EST陽性細胞和8-OH-dG陽性細胞的關聯比較。B：外周角膜中EST陽性細胞數量的柱狀圖；H2組和生理鹽水組之間存在明顯的統計學差異。C：使用低真空掃描電子顯微鏡和PAM染色，比較兩組的膠原纖維和浸潤細胞。

圖4A顯示了6小時后角膜緣和第1天角膜中央的EST陽性中性粒細胞，以及第1天角膜中央的8-OHdG陽性細胞。在這里，EST陽性的中性粒細胞直接浸潤了8-OHdG陽性角膜近端的區域基質細胞，表明自由基的參與。與生理鹽水組相比，H2組在這兩個時間點觀察到的中性粒細胞數量明顯較少（圖4B）。此外，LV-SEM顯示，與生理鹽水組相比，H2組基質膠原纖維的結構發生了變化，纖維內的炎性細胞數量也減少了（圖4C）。

圖5H2和生理鹽水處理的角膜中巨噬細胞的表型評估A：兩組角膜中心組織ED1（紅色箭頭）和ED2（藍色箭頭）免疫染色的代表性圖像。B：外周角膜中ED1陽性巨噬細胞數量條形圖；H2治療顯著減少了ED1陽性巨噬細胞的數量。C：周圍角膜中ED2陽性巨噬細胞數量條形圖。

此外，ED1和ED2免疫染色分別用于檢測泛巨噬細胞和M2巨噬細胞的浸潤（圖5A）。值得注意的是，H2明顯減少了ED1陽性泛嗜酸性粒細胞的浸潤，而ED2陽性M2巨噬細胞的浸潤則明顯增加（圖5B和5C）。

5.H2對SOD1酶活性的影響

圖6 H2治療后細胞質SOD1表達增加A：堿損傷后傷口愈合過程中SOD1（箭頭）免疫染色角膜上皮細胞的代表性圖像；B：條形圖顯示隨著時間的推移，SOD1在H2給藥過程中被激活；C：條形圖顯示在損傷后6小時，H2組與生理鹽水組和正常角膜相比，中央角膜細胞質SOD1表達顯著上調。

為了研究H2對抗氧化酶的潛在影響，我們研究了SOD1的蛋白水平。值得注意的是，H2組角膜上皮細胞的細胞質SOD1水平明顯高于生理鹽水組（圖6A）。這些SOD1水平在注射H2后立即升高，然后隨著時間的推移逐漸降低（圖6B）。受傷后6小時，H2組角膜中央的SOD1表達相對于未受傷的對照組增加了約4.8倍，而生理鹽水組僅增加了1.8倍（圖6C）。

討論：

在堿燒傷的角膜上經常可以觀察到強烈的炎癥和隨后的新生血管。因此，觀察到的H2的作用使人們對其在堿引起的角膜損傷中的應用產生了濃厚的興趣。H2可選擇性地減少羥基自由基，而羥基自由基是細胞毒性最強的活性氧。此前，Kubota等人評估了H2在SOD1缺乏的小鼠角膜堿燒傷模型中的作用。他們的研究結果證明堿燒傷的氧化性質，并證明了H2在角膜中的抗血管生成作用。在本研究中，我們觀察到的H2抗血管生成作用與Kubota等人的研究結果一致。在我們的實驗中，JG12的免疫組化染色顯示H2組顯著抑制了新生血管的形成。

此外，我們還對浸潤受傷角膜組織的炎性細胞進行了詳細分析。免疫組化染色顯示，在損傷后的所有時間點，H2組浸潤的中性粒細胞數量都明顯少于生理鹽水組。我們進一步觀察到浸潤性中性粒細胞與8-OHdG陽性細胞之間的關聯，并發現H2能顯著抑制這兩種細胞的數量。由于H2是一種自由基清除劑，我們的研究結果表明，氧化應激的減少可能有助于抑制炎癥細胞的入侵，這與之前的報告一致。我們通過使用LV-SEM觀察角膜膠原蛋白進一步證實了這一效果，LV-SEM是一種廣泛用于評估光鏡下組織標本三維超微結構變化的模式。H2有助于維持基質膠原纖維的正常排列，這是角膜透明度的一個重要因素。

我們還觀察到H2對巨噬細胞浸潤的顯著影響。具體來說，用H2處理可顯著減少ED1陽性泛巨噬細胞的浸潤，同時顯著增加ED2陽性M2巨噬細胞的浸潤。值得注意的是，M1巨噬細胞是炎癥細胞，而M2巨噬細胞能消除炎癥，因此在組織重塑和傷口愈合中發揮著關鍵作用。以往的角膜研究報告表明，M2巨噬細胞在角膜組織的傷口修復過程中發揮作用。因此，我們觀察到H2治療能促進M2巨噬細胞的表達，這表明這種療法有可能應用于臨床。不過，還需要進一步的實驗來闡明M1/M2平衡的病理機制。

眾所周知，SOD是抗氧化應激途徑中的重要角色。在這些酶中，SOD1在大多數組織中表達，其活性占SOD活性的90%。在SOD1缺乏的動物中，自由基誘導的損傷會導致退行性或炎癥性疾病。相反，使用灌注法大量增加眼內外源性SOD1的水平似乎能通過解決氧化應激減輕炎癥。Murakami等人報道說，用H2處理可通過Nrf2途徑誘導SOD，從而間接減輕氧化應激。因此，在本研究中，我們假設SOD1可能參與了H2間接抑制自由基的機制。與這一假設相一致的是，我們觀察到角膜上皮細胞的細胞質SOD1在H2的作用下活化，甚至在傷口愈合的早期階段也是如此。綜上所述，這些結果表明，H2的抗氧化作用不僅包括直接清除自由基的作用，還包括激活SOD1的作用，這與之前的一項神經學研究一致，在該研究中，H2被認為是治療肌萎縮性脊髓側索硬化癥的有效候選藥物，而肌萎縮性脊髓側索硬化癥涉及細胞質SOD1的突變。

總之，我們對堿誘導的角膜損傷的研究表明，H2不僅通過抑制自由基，還通過誘導SOD1的活化來發揮抗炎作用。進一步了解H2的這些特征性作用可能有助于制定更多的眼科治療策略。