摘要：

目的：探討氫(H2)對大鼠角膜堿燒傷模型中銅鋅超氧化物歧化酶(SOD1)活性的影響。方法：每只大鼠的一個角膜接受堿暴露。堿暴露前和堿暴露后，分別在角膜上持續滴注生理鹽水(生理鹽水組)或氫溶解鹽水(H2組)5min。用免疫組織化學方法檢測兩組摘除眼的炎細胞、新生血管和胞漿SOD1水平。用低真空掃描電子顯微鏡分析眼內三維超微結構變化。結果：H2組角膜炎癥細胞數和血管內皮細胞數均明顯減少(P<0.01)。此外，H2處理還可增加角膜上皮細胞胞漿SOD1水平(P<0.01)和活性(P<0.01)。值得注意的是，H2組的SOD1活性水平大約是生理鹽水組的2.5倍。結論：H2治療可抑制角膜損傷后炎癥反應和新生血管形成，并通過上調SOD1酶蛋白水平和活性間接抑制角膜氧化損傷。

引言：

自2007年我們首次提出氫氣（H2）通過選擇性還原細胞毒性氧自由基作為治療性抗氧化劑以來，已有多項研究證明了氫氣的作用，并提出了其在治療方面的應用潛力。因此，H2醫學領域正在迅速發展，目前有超過25項臨床研究（包括雙盲臨床試驗）正在評估H2的治療效果。更具體地說，眼科研究人員已經報道了H2在視網膜動脈閉塞、角膜堿燒傷和白內障超聲乳化手術中直接降低氧化應激的應用。但值得注意的是，也有報道稱H2可通過其他途徑間接抑制氧化應激。

細胞質Cu、Zn超氧化物歧化酶（SOD1）參與抗氧化應激，其活化是H2醫學研究中發現的一個途徑。SOD1可調節活性氧水平，從而在組織穩態中發揮重要作用。有報告顯示，H2參與了SOD1的活性，并認為前者間接抑制了抗氧化應激。但迄今為止，很少有報告描述H2在眼科環境中激活SOD1的作用。

因此，在本研究中，我們通過明確H2對角膜堿燒傷模型中SOD1活性的影響，評估了H2對炎癥和新生血管形成的影響，以及對氧化應激的間接影響。

材料與方法：

倫理批準：

所有基于動物的實驗均遵照日本醫科學校實驗動物倫理審查委員會的規定進行。所有程序均符合視覺研究協會和眼科與視覺研究協會的指導方針。

動物：

八周大的雄性Wistar大鼠，體重200克。大鼠飼養在特定的無病原體環境中，12小時光照/12小時黑暗循環。在整個實驗過程中提供水和食物，并提供持續的臨床護理（每天24小時/每周7天），以確保在需要時及時干預。

堿燒傷模型和H2溶解生理鹽水的制備：

在3.5%異氟醚吸入麻醉下，每只大鼠的一只眼睛（共104只）按照以下方案進行堿燒傷：將一張浸泡在1mol/L NaOH中的圓形濾紙放在角膜中央1分鐘。在堿暴露前用生理鹽水（生理鹽水組：39只）或H2溶解生理鹽水（H2組：39只）滴注（10mL/min）沖洗角膜5分鐘，并在堿暴露后再次沖洗角膜。每只大鼠均以未受傷的正常角膜作為對照。

H2溶解生理鹽水的制備方法見我們之前的報告:

簡而言之，將市售生理鹽水塑料袋放入充滿H2氣體的丙烯酸真空室中24小時（圖1A）。使用前，使用針式H2電極（Unisense，丹麥奧胡斯）確認每個袋中H2的溶解濃度。在所有實驗中，溶解了H2的生理鹽水都是在從真空室取出后5分鐘內使用的。

堿傷后6小時、1天和7天，在3.5%異氟醚吸入麻醉下，對大鼠進行放血安樂死。對去核眼球進行組織學和免疫組化檢查，并進行低真空掃描電子顯微鏡檢查。整個實驗期間未發現任何不良反應。

組織學和免疫組化分析及LVSEM觀察：

將去核眼球（每組/每個終點n=8只）固定在10%的緩沖福爾馬林中，用石蠟包埋，然后進行光學顯微鏡觀察。隨后，去石蠟組織切片（厚度：2.5μm）用蘇木精和伊紅（HE）染色，用NaphtolAS-D氯乙酸酯酶（EST）檢測浸潤的中性粒細胞，并用LV-SEM染色。對于后者，用周期性酸-甲酚胺銀（PAM）對組織進行染色，以明確膠原。

為了對炎癥細胞、新生血管和SOD1酶水平進行免疫組化分析，在兩個角膜區域（中心：3個視野，周邊：2個視野）的高倍視野（放大率：400×）中對每個樣本的陽性細胞數量進行病理測量。使用的一抗如下

1）單克隆小鼠抗氨基肽酶P抗體（JG12）用于檢測血管內皮細胞；

2）單克隆小鼠抗8-OHdG抗體（JaICA）用于檢測DNA氧化應激；

3）單克隆小鼠抗CD68抗體（ED1）；

4）單克隆小鼠抗CD163抗體（ED2）檢測M2巨噬細胞；

5）多克隆兔抗SOD1抗體（Stressgen）檢測SOD1酶。

如上所述，用于LV-SEM的樣本需進行PAM染色以增強對比度。用PAM染色后，通過LV-SEM對沒有安裝蓋玻片的標本進行檢查。使用15kV的加速電壓和30Pa的反向散射電子探測器評估角膜傷口的超微結構變化。

統計分析：

所有結果均以均數±標準差（SD）表示。統計分析使用分析軟件程序進行。比較采用學生t檢驗。當P<0.05時，結果具有統計學意義。