光催化產生H2的測量結果

使用外部光源(350W Xe燈)測量光催化產生的H2。在厭氧室的厭氧條件下，在100毫升血清瓶中準備了20毫升含有1毫摩爾(NH4)2Fe(SO4)2、1毫摩爾NiCl2、100毫摩爾抗壞血酸和5毫摩爾MV2+的LB培養基和工程大腸桿菌細胞。系統被抽空，以去除手套箱大氣中的N2和H2。在反應開始后加入IPTG，先后誘導CdS納米粒子的原位合成和氫化酶的過表達。用微型注射器直接將樣品注入氣體采樣器，然后用氣相色譜儀分析產生的H2量。然后將樣品注入配備熱導檢測器的氣相色譜儀(Kejie GC5890C，配有硅膠柱和熱導檢測器傳感器)，以同時測定H2、O2和N2的濃度。為了在有氧條件下進行測量，對厭氧條件下制備的反應系統進行了仿生物硅膠封裝。

仿生硅膠封裝

通過離心收集含有CdS納米粒子的工程大腸桿菌細胞，然后對其進行Choi等人描述的仿生二氧化硅封裝方案。工程細胞在PDADMAC溶液和PSS溶液中交替浸泡，每步5分鐘。LbL過程結束后，將多層包裹的細胞放入50mM硅酸溶液中。最后通過離心收獲封裝的生物雜交聚集體，并均勻分散成2000微米的顆粒。

微電極測量

O2微電極是一種尖端直徑為25μm的OX25微電極(Unisense)。通過用O2微電極刺穿聚集的大腸桿菌來檢測其體內的O2濃度。新鮮制備的聚合大腸桿菌細胞用于在有氧條件下至少12小時的產氫測量。然后，從反應系統中收獲聚集體。將單層聚集體固定在瓊脂基底(瓊脂重量百分比為1%)上，當微電極尖端刺入聚集體時，微機械手的步長為1μm。

結果

CdS納米粒子的生物合成

我們首先探索了大腸桿菌細胞對CdS納米粒子的生物合成。CdS是一種經過深入研究的半導體，其光催化活性已在生物無機雜化系統中得到充分驗證。然而，這種半導體的合成需要復雜的工藝和昂貴的試劑。添加的外源金屬材料的生物相容性也會影響生物反應器的效率。Yang等人利用非光合細菌Moorella thermoacetica開創了從二氧化碳中光合作用合成醋酸的混合策略，取得了關鍵性進展，該細菌展示了生物沉淀CdS納米粒子的獨特代謝途徑。受Yang及其同事研究的啟發，我們意識到，我們先前設計的大腸桿菌細胞表面顯示了一種鉛特異性結合蛋白PbrR，可能會發揮與Moorella thermoacetica類似的功能。PbrR蛋白含有三個保守的半胱氨酸殘基，它們通過獨特的半定向幾何結構協調鉛(II)金屬中心。PbrR蛋白在大腸桿菌細胞表面的顯示允許選擇性吸附鉛和鎘離子，并在細胞外膜上形成PbS和CdS納米顆粒。此外，作為基因工程中最重要的微生物，大腸桿菌在基因組和代謝機制方面已得到了深入研究，并已成為合成生物學中最重要的細胞模式。因此，將光合生物雜交系統應用于大腸桿菌細胞是非常可取的，從而擴大了其應用范圍。

圖2大腸桿菌細胞-CdS混合系統的氫光合作用。(A)工程大腸桿菌細胞詳圖。(B)工程大腸桿菌細胞表面生物合成的CdS納米粒子的TEM圖像。(C)隨機選擇的CdS納米粒子的EDX確認。(D)混合系統在厭氧條件下產生的H2。(E)混合系統在輻照過程中產生H2的速率變化。

隨后，我們研究了表面顯示PbrR的大腸桿菌細胞，以用于CdS納米粒子的生物沉淀。我們將先前研究中構建的包括大腸桿菌外膜蛋白A(OmpA)和PbrR蛋白的融合蛋白表達質粒轉化到大腸桿菌菌株BL21中(圖2A)。

用阿拉伯糖誘導表面顯示的PbrR蛋白的表達，并在培養基中加入Cd2+引發CdS納米顆粒的生物沉淀。我們使用透射電子顯微鏡和能量色散X射線光譜(TEMEDX)觀察了CdS納米粒子的沉淀過程。如透射電子顯微鏡圖像所示，鎘離子在細胞表面積聚并形成了大小小于50nm的均勻納米粒子團(圖2B)，這在Yang等人對M.thermoacetica-CdS雜交體系的研究中也觀察到了。此外，對隨機選擇的包含部分CdS納米顆粒的區域進行的EDX分析也證實了其元素組成(圖2C)。使用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)測量了PbrR表達的大腸桿菌細胞表面生物合成的CdS納米顆粒的數量，24小時后達到8.09±0.70μg/108 cells，該數值遠高于未顯示PbrR的細胞。這些數據證實了表面顯示的PbrR介導的CdS納米粒子在細胞外膜上的生物沉淀。

大腸桿菌細胞-CdS混合系統的氫光合作用

我們進行了紫外-可見(UV-vis)光譜測量，以直接確定這些CdS納米粒子的光帶隙能以及CdS納米粒子在細菌細胞外膜上生物沉淀的光催化能力。在太陽光譜的可見光區域檢測到了生物合成的CdS納米粒子的最低能量轉變(Eg=2.92eV，λabsorption=424nm)，證實了原位生物合成的CdS納米粒子的光催化能力。反應溶液中還含有抗壞血酸和甲基維生物素(MV2+)。抗壞血酸通常用作再生CdS納米粒子的犧牲電子供體。氧化還原染料MV2+是一種成熟的電子介質。結合MV2+，半導體/細菌細胞混合系統很容易成為H2光合作用的生物催化劑。在厭氧條件下測量了各實驗組中還原MV的濃度，證實了沉淀在工程大腸桿菌細胞上的CdS納米粒子能吸附光子并將電子傳遞給MV2+。利用氣相色譜法(GC)檢測了該混合系統在厭氧條件下產生的H2量。在無光條件下，由于內源表達的氫化酶介導的厭氧發酵，在有或沒有CdS的情況下，工程大腸桿菌細胞產生了微量的H2。然而，在350瓦Xe燈的照射下，攜帶CdS納米粒子的工程大腸桿菌細胞(1×108個)在6小時后形成近13.40±1.20μmol H2，24小時后達到81.80±7.39μmol，這一數值明顯高于其他處理的數值(圖2D)。此外，該雜交系統的H2光合作用速率在最初的18小時內從每小時0.56μmol/108個細胞穩步上升到1.15μmol/108個細胞，隨后由于細菌死亡而開始下降(圖2E)。根據這些結果，我們的工程大腸桿菌細胞-CdS雜交系統在厭氧條件下產生的H2與生物合成的CdS半導體和全細胞生物催化劑的活性直接相關。