目的：慢性銅綠假單胞菌肺部感染是囊性纖維化（CF）患者最嚴重的并發癥。CF患者受感染的支氣管內粘液含有厭氧區，主要是由于多形核白細胞的呼吸爆發。我們最近證明了銅綠假單胞菌感染患者的痰液中存在持續的反硝化作用。因此，我們的目的是研究幾種已知CF病原體的致病性是否與其反硝化能力相關。

方法：我們使用一氧化二氮(N2O)微電極測量反硝化作用，并通過吸光度變化和菌落計數對來自32名慢性感染高致病性細菌銅綠假單胞菌、木糖氧化無色桿菌、多食伯克霍爾德菌或低致病性細菌嗜麥芽寡養單胞菌的CF患者的分離株進行厭氧生長測量。估算NO3-和NO2-的消耗量，所有分離株均在含有NO3-或NO2-的厭氧LB肉湯中培養2天進行測定。16S rRNA的PNA FISH染色用于估計每個細菌細胞的核糖體量，從而估計痰中嗜麥芽糖鏈球菌的原位生長率。

結果：補充NO3-導致5銅綠假單胞菌、木糖氧化放線菌和多食芽孢桿菌產生N2O增加，并促進所有病原體的生長。然而，嗜麥芽糖鏈球菌的生長速度最低。NO3-被所有病原體代謝，但只有銅綠假單胞菌能夠去除NO2-。通過弱PNA FISH染色可以看出，嗜麥芽糖鏈球菌在痰中的生長有限。

結論：所有四種病原體都能夠通過NO3-還原進行厭氧生長。然而，在嗜麥芽糖鏈球菌分離株中并未發現N2O產生所證明的反硝化作用。進行反硝化的能力可能有助于傳染性分離株的致病性，因為完全反硝化促進更快的厭氧生長。嗜麥芽糖鏈球菌無法通過反硝化作用增殖，因此無法在厭氧CF痰中生長，這可能解釋了其對CF患者的低致病性。

前言:

囊性纖維化是一種常染色體隱性遺傳病，銅綠假單胞菌、木糖嗜鉻桿菌、多食伯克霍爾德氏菌和嗜麥芽窄食單胞菌等革蘭氏陰性桿菌可引起CF患者呼吸道慢性感染。銅綠假單胞菌、木糖擬單胞菌和多食單胞菌會導致慢性肺炎組患者在慢性感染后肺功能嚴重惡化。慢性嗜麥芽窄食單胞菌感染的肺功能惡化較慢，甚至長期穩定。

銅綠假單胞菌慢性肺部感染的主要致病菌，存在于支氣管內粘液中被多形核白細胞(PMN)包圍的生物膜聚集體中，其中包含厭氧區。這種厭氧主要是由宿主細胞引起的，因為中性粒細胞為了產生超氧化物而強烈消耗氧氣，其次是產生一氧化氮(NO)和肺上皮呼吸，而微生物需氧呼吸消耗的氧氣很少。盡管有厭氧菌，銅綠假單胞菌仍在支氣管內分泌物中生長并持續存在。這種厭氧生長提供能量的機制顯然包括反硝化作用，因為支氣管內分泌物中持續產生一氧化二氮(N2O)以及反硝化標志物OprF porin，而且痰和氣管吸出物中的氨濃度隨著抗菌治療而降低。精氨酸發酵也可能有助于銅綠假單胞菌的生存，盡管其能量產量遠低于好氧或無氧呼吸。在好氧生長過程中也可能發生反硝化作用，盡管反硝化作用的速率與O2濃度成反比。

反硝化作用可能有利于銅綠假單胞菌的生物膜粘液表型，這種表型是慢性感染的特征，因此在CF中具有高致病性，并可能促進生長，并增加對抗生素的耐受性。因此，反硝化作用可能與慢性銅綠假單胞菌肺部感染的致病性有關。

本研究中使用的三個高致病性分離物已知有能力將NO2?還原到亞硝酸鹽(NO2?)之外，但對嗜麥芽窄食單胞菌沒有。因此，通過比較高致病性銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食桿菌、多食桿菌和低致病性嗜麥芽窄食單胞菌的反硝化作用，我們推測反硝化作用與病原菌的致病力有關。反硝化被量化為N2O的缺氧釋放，這是反硝化的標志，在添加了N3?和NO2?的慢性感染的CF患者中分離的N2O微電極進行了反硝化，此外，通過傳統的生長測定方法以及新開發的PNAFISH染色技術來確定NO2?和NO2?對厭氧生長的影響。

材料和方法：

病人：四種病原體的慢性感染：在痰標本培養中檢測到細菌超過6個月，或在抗體反應增強的情況下，在較短的時間內檢測到細菌的存在。

痰標本:本研究對3例慢性嗜麥芽窄食單胞菌感染患者在放棄知情同意的情況下獲得口服許可后，取痰作常規細菌學檢查。

細菌:12株銅綠假單胞菌Cf分離株，9株木霉Cf分離株，9株多食桿菌Cf分離株和7株嗜麥芽寡養單胞菌Cf分離株.

刮取細菌被稀釋在100ml肉湯培養24h(150rpm，37?C)。在分光光度計中記錄OD600，50ml培養物在磷酸鹽緩沖鹽水中洗兩次，然后5000rpm，4?C，10min。將小球重新懸浮在5ml PBS中。實際細菌含量通過在藍色平板上電鍍0.9%氯化鈉的連續稀釋的CFU計數來估計。

媒介：用KNO3或NaNO2添加LB肉湯，以獲得10 mM的最終濃度。然后將培養基經無菌過濾(0.2 L)至50ml用半透膜密封的試管中，然后置于37?C的缺氧氣氛中72h。

慢性感染CF患者細菌分離株的厭氧處理：在缺氧條件下將過夜培養物接種到含有10 mM KNO3或10 mM NaNO2的LB肉湯中，以達到2ml中≈106CFU/ml的最終濃度。玻璃瓶放置培養24和48h(150rpm，37?C)。

生長測量：在測量N2O之前，將玻璃瓶放置在雙光束分光光度計中，并測量OD600。以Lb肉湯作為參照物。在N2O測量后，通過在藍色瓊脂平板上連續稀釋0.9%的氯化鈉來估計樣品的菌落形成單位(CFU)。

N2O的微傳感器測量：將玻璃瓶放置在加熱的金屬架上，保持在37?C下，用安裝在電動PC控制輪廓裝置中的電流型N2O微型傳感器記錄N2O濃度。微傳感器(尖端直徑100m)手動放置在樣品中。

通過在實驗溫度和鹽度下測量不含N2O的PBS中的傳感器信號以及在PBS中順序添加已知體積的N2O不同濃度來線性校準N2O微傳感器。飽和PBS中的N2O濃度是根據微量氣體計測量的N2O溶解度來估計的。

NO3?和NO2?定量測定:NO3?標準曲線用于測定總NO3?和NO2?濃度，而NO2?標準曲線用于單獨測定NO2?。NO2?濃度減去總NO3?濃度和NO2?濃度即可估算出NO3?濃度。

增長率的測量：從痰中分離出的嗜麥芽寡養單胞菌在37?C的LB發酵液中獲得了純培養生長率。將過夜的嗜麥芽寡養單胞菌培養物稀釋到250ml燒瓶中的100mlLB肉湯中，在200rpm至OD600=0.05時，允許培養物增殖(37?C，200rpm)。當OD600達到0.5時，培養物被稀釋到OD600為0.05，通過監測OD600隨時間的變化來測量后增長率。生長率用比生長率(每小時數)表示。

嗜麥芽寡養單胞菌的固定化：將分離的嗜麥芽寡養單胞菌L固定在一滴固定液中，混合在顯微鏡載玻片上。固定細胞在65?C下，在數字干浴上孵育20分鐘。將咳出的痰固定在一次性乙烯基樣模中。固定樣品用?80?C己烷(SIGMA)快速冷凍。

痰標本的冰凍切片：將快速冷凍的塊在?18?C低溫恒溫器上切成8um厚的切片。切片固定在顯微鏡載玻片上。

全細胞雜交：將一滴嗜麥芽寡養單胞菌的探針加到固定的嗜麥芽寡養單胞菌的玻片上，蓋上22 mm×22 mm的蓋片，55?C孵育90min，然后在4ml60×洗滌液中孵育30min，洗滌液稀釋到240mlMilliq H2O中，然后在黑暗中風干15min。此外，對于痰標本，加入100 L Syto 59(Invitgen)1000×氯化鈉溶液進行染色，然后孵育15min，然后進行PBS漂洗和黑暗中風干。在幻燈片上加一滴硬質安裝介質，用蓋片密封，風干10分鐘。

顯微技術和圖像分析:用蔡司顯微鏡以及隨附的蔡司軟件掃描安裝的樣品載玻片。熒光成像采用63×1.4油物鏡，使用免費軟件Image J(美國國立衛生研究院)對單個細胞的熒光進行量化。細胞和背景信號之間的區別是通過使用圖像J的自動“多閾值”宏閾值來完成的。為了定量，使用了Image J函數“分析粒子”。對于每個被分析的菌株，我們使用17,000平均熒光強度單位作為區分生長和不生長的最低檢測下限。