8.Hm保護細胞免受輻射損傷

圖5：6Gy輻射24小時后，氫氣保護IEC-6細胞免受輻射誘導(dǎo)的損傷。(A)6Gy輻射24小時后IEC-6細胞的相位對比圖像。(B)輻射6Gy后24小時死亡細胞Hoechst染色的代表性顯微照片。(C）輻射6Gy后24小時，壞死細胞PI染色的代表性顯微照片。(D)用附件素V-PI染色細胞，并用流式細胞術(shù)分析6Gy劑量輻射后24小時的細胞，凋亡細胞的直方圖以占總細胞的百分比表示。(E）細胞存活率直方圖以各組的OD值。

相位對比圖像顯示，輻射誘導(dǎo)的細胞縮小了，而氫氣處理阻止了這種變化（圖5A）。此外，我們還使用了兩種方法來證實氫氣也能防止細胞損傷：Hoechst（死亡細胞）和PI染色（壞死細胞）。此外，我們還通過流式細胞術(shù)對細胞凋亡進行了定量評估。與Rc組相比，Rh組的IEC-6細胞凋亡率降低了兩倍（圖5D）。此外，我們還測量了細胞存活率，并證實Hm處理可保護細胞存活率（圖5E）。

9.Hm對6Gy輻射后線粒體凋亡途徑的影響

圖6：氫氣緩解線粒體去極化并調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑。(A）用JC-1染色IEC-6細胞，并用熒光顯微鏡測定線粒體膜電位的變化。此外，在給予6Gy輻射30分鐘后，用流式細胞儀量化紅/綠熒光密度比。B)在6Gy輻射處理后6小時，對線粒體（Mito）和細胞質(zhì)（Cyto）中的細胞色素c（CytC）進行Western印跡分析。(C)在6Gy輻射后6小時，對裂解的caspase-9、裂解的caspase-3和RARP進行Western印跡分析。(D)在接受6Gy輻射6小時后，還對Bax、Bcl-2和Bcl-xl進行了Western印跡分析。

還通過熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測線粒體膜電位（MMP），探討了氫氣對輻射誘導(dǎo)的細胞凋亡的保護作用。與S組相比，受到輻射刺激的細胞顯示出更高水平的綠色熒光強度和更低水平的紅色熒光強度，這表明輻射照射后MMP明顯降低。然而，用Hm處理明顯阻止了MMP的下降（圖6A）。

線粒體凋亡途徑包括細胞色素c的釋放以及caspase-9、caspase-3和PARP的活性。在我們目前的研究中，輻射導(dǎo)致細胞色素c釋放到細胞質(zhì)中（圖6B），隨后caspase-9、caspase-3和PARP被激活（圖6C）。然而，Hm的存在明顯阻止了這些變化。

討論：

在本研究中，我們證實：(1)氫氣處理減輕了暴露于WR的小鼠的腸道損傷并改善了腸道功能；(2)氫氣處理抑制了暴露于WR的小鼠的氧化應(yīng)激損傷和全身炎癥反應(yīng)；(3)氫氣處理抑制了暴露于WR的小鼠的細胞凋亡并維持了腸上皮細胞的增殖；(4)氫氣處理可防止IEC-6細胞在6Gy輻射劑量下形成ROS；(5)氫氣處理可保護IEC-6細胞免受輻射引起的損傷；(6)氫氣處理可緩解IEC-6細胞在6Gy輻射劑量下的線粒體去極化并阻斷線粒體凋亡途徑。

RT引起的腸道損傷是癌癥患者面臨的一個重要臨床問題。RT的目標(biāo)是在對腫瘤細胞產(chǎn)生最大毒性的同時，限制對周圍正常組織的傷害。科學(xué)家們不斷尋找新的、高效且無毒的藥物，包括用于放射保護的抗氧化劑。目前，大量數(shù)據(jù)表明，氫氣可選擇性地還原-OH，從而有效保護組織免受氧化損傷。與其他抗氧化劑相比，氫氣有幾個獨特的優(yōu)點：(1)它的副作用最小，因為它存在于人體和大氣中；(2)它性質(zhì)溫和，不會干擾新陳代謝的氧化還原反應(yīng)，也不會破壞參與細胞信號傳導(dǎo)的ROS；(3)它的分子量最小，能輕易穿透細胞膜，靶向細胞器，包括線粒體和細胞核。由于這些獨特的優(yōu)勢，氫氣具有理想的輻射防護特性，此前已有多部著作描述了氫氣對輻射引起的器官損傷以及心肌、胃腸道和造血干細胞的保護作用。

腸粘膜是易受輻射損傷的組織。輻照后，腸粘膜壞死會導(dǎo)致進食障礙、嚴重營養(yǎng)不良，危重者甚至死亡。目前的研究表明，氫氣有助于維持腸粘膜的完整性，降低DAO和iFABP的水平，而DAO和iFABP都是腸粘膜損傷的敏感標(biāo)志物（圖2D和E）。此外，氫氣處理還能增加小鼠的進食量和體重，并最終減少小鼠的死亡，表明氫氣可能對輻射引起的腸道損傷有保護作用（圖1B、C和D）。同樣，XiaoHW等人在2018年證明，口服灌胃氫水可增加食物攝入量和存活率，維持腸黏膜的完整性，從而改善輻射誘導(dǎo)的胃腸毒性。除了抗氧化能力，作者還重點研究了氫氣對腸道微生物群的影響。

有報道稱，氫氣可減少心肌和造血干細胞在WR后的氧化應(yīng)激損傷。輻射過程中產(chǎn)生的ROS暴發(fā)在輻射引起的腸道損傷的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用。本實驗表明，氫氣可降低脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物MDA的水平，減少由-OH引起的DNA氧化的主要產(chǎn)物之一8-OHdG，提高細胞內(nèi)源性重要抗氧化酶SOD的活性，抑制中性粒細胞聚集指標(biāo)MPO的活性（圖3A、B和F），從而部分恢復(fù)了相對較低的抗氧化能力，緩解了氧化/還原平衡的破壞。我們將這種利用外源性氫處理來減少氧化和還原失衡的細胞保護新方法稱為"氫復(fù)蘇"。

腸道輻射損傷引起的腸道細菌轉(zhuǎn)運將導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。在我們目前的研究中，氫氣的輸送也抑制了血清中TNF-α和IL-6水平的升高，這表明氫氣在一定程度上阻止了系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的發(fā)生（圖3C-E）。

科學(xué)家們已經(jīng)證明，細胞過度凋亡是導(dǎo)致RT引起的消化道綜合征的主要病因之一。在本研究中，我們證明氫氣可減少小鼠暴露于致死劑量為10Gy的WR誘導(dǎo)的細胞凋亡。腸隱窩增殖可促進細胞向上遷移，并產(chǎn)生填充絨毛的終末分化細胞，這些作用必須發(fā)生才能使腸粘膜從損傷中恢復(fù)。在我們的研究中，雖然輻射導(dǎo)致細胞增殖率急劇下降，但氫處理卻能維持細胞增殖，這可能會促進腸粘膜從輻射引起的損傷中恢復(fù)過來（圖2A-C）。

在體外實驗中，我們選擇了常用于研究輻射引起的腸道損傷的IEC-6細胞系，以研究氫氣的保護作用及其內(nèi)在機制。在體內(nèi)，由于ROS的高反應(yīng)性和短半衰期，很難捕獲和測量ROS。在本研究中，我們使用了兩種經(jīng)典的熒光探針（DCFH-DA和DHE）來研究氫氣對輻射誘導(dǎo)的ROS在體外形成的影響。我們的研究表明，氫氣處理能顯著抑制ROS的激增（圖4A-C），這可能是氫氣防輻射的基本作用機制。

這些結(jié)果與Zhang等人的研究結(jié)果一致，他們證明富氫培養(yǎng)基可降低體外4GyIR劑量下骨髓細胞的ROS水平和DNA損傷。為了與動物實驗保持一致，我們還研究了氫氣對輻射誘導(dǎo)的細胞損傷的影響。通過Hoechst和PI染色結(jié)果以及流式細胞術(shù)分析，我們的研究表明氫氣處理可減少細胞凋亡并維持細胞活力，這表明氫氣可保護IEC-6免受輻射誘導(dǎo)的細胞損傷（圖5A-E）。

以往的研究表明，輻射誘導(dǎo)的ROS過度產(chǎn)生是通過線粒體通透性轉(zhuǎn)換機制放大的。由于氫在所有元素中分子量最小，因此很容易滲透到線粒體中，保護線粒體免受氧化損傷。因此，我們假設(shè)氫氣可能通過線粒體保護對輻射引起的損傷具有細胞保護作用。首先，我們目前的研究表明，氫氣可明顯緩解輻射誘導(dǎo)的線粒體去極化，并維持線粒體凋亡蛋白。此外，本研究還對涉及線粒體途徑的促凋亡分子的活性進行了研究。

細胞色素c是一種保存完好的電子傳遞蛋白，是線粒體膜間隙呼吸鏈的一部分。在我們目前的研究中，輻射刺激導(dǎo)致細胞色素c釋放到細胞質(zhì)中，進而激活caspase-3、caspase-9和PARP，最終導(dǎo)致細胞凋亡。我們的研究表明，氫氣可阻止細胞色素c的釋放，并抑制caspase-9、caspase-3和PARP的過度激活。

此外，我們還研究了與線粒體凋亡途徑相關(guān)的Bax、Bcl-2和Bcl-xl的表達。Bax蛋白從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體是觸發(fā)死亡信號的關(guān)鍵步驟，而Bcl-2和Bcl-xl可通過阻止細胞色素c從線粒體釋放來防止細胞凋亡。我們目前的研究還表明，氫氣能阻止Bax的表達增加，減少Bcl-xl和Bcl-2L的表達，這與之前的研究一致。所有這些研究都表明，氫氣可能由于參與阻斷線粒體凋亡途徑而發(fā)揮保護作用（圖6C、D和E）。

重要的是，我們的研究顯示氫氣的治療時間窗相對較窄。我們目前的研究提供的證據(jù)表明，一旦在輻射后30分鐘給藥，氫氣的治療效果就微乎其微，這意味著氫氣的預(yù)防效果可能比治療效果更有效。

總之，我們的研究同時證明，氫氣對輻射引起的腸道細胞損傷具有明顯的保護作用。在體外，我們的研究表明氫氣的保護作用與阻斷線粒體凋亡途徑有關(guān)。由于氫氣的獨特優(yōu)勢，開發(fā)與氫氣相關(guān)的抗氧化方法來治療輻射誘導(dǎo)的消化道綜合征也許是有可能的。