摘要：

眾所周知，小腸對輻射特別敏感，放療的主要限制因素是用藥后出現的胃腸道綜合征。輻射的有害影響主要是通過過量產生活性氧（ROS），尤其是羥自由基（-OH）來介導的。由于氫氣是一種選擇性-OH清除劑，我們假設氫氣可能對輻射引起的腸道損傷具有保護作用。在此，我們在小鼠和腸隱窩上皮細胞（IEC-6）系中建立了輻射模型。在動物實驗中，我們證明富含氫氣的生理鹽水能顯著減少輻射引起的腸粘膜損傷，改善腸道功能，提高存活率。此外，氫氣處理還減輕了輻射引起的氧化應激損傷和全身炎癥反應。此外，氫氣處理還能減少細胞凋亡，維持小鼠腸上皮細胞的增殖。使用IEC-6細胞系進行的體外實驗表明，富氫培養基能顯著抑制ROS的形成，維持細胞活力，抑制細胞凋亡。重要的是，氫處理可防止線粒體去極化、細胞色素c釋放以及caspase-3、caspase-9和PARP的活性。此外，Bcl-xl和Bcl-2蛋白表達的減少以及Bax蛋白表達的增加也被阻斷。

引言：

放射治療（RT）是癌癥多模式治療的一個重要方面，在根除惡性細胞方面發揮著重要作用，但也不可避免地會對正常組織造成損傷。胃腸道（GI）黏膜是對輻射反應較早的組織，因為其增殖迅速且持續不斷。據估計，大約50%的接受RT治療的患者會出現長期慢性消化道癥狀，影響其日常活動。

由于腸隱窩細胞增殖迅速且持續不斷，因此最容易受到輻射的影響。據報道，低至1Gy的輻射劑量可導致小鼠小腸隱窩細胞凋亡在輻射照射后3-6小時內急劇增加。以往的研究表明，輻射誘導的細胞凋亡與線粒體凋亡途徑有關，線粒體凋亡途徑的特點是細胞色素c的釋放以及caspase9和多（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的活性。

輻射對生物組織的有害影響主要是通過增加活性氧（ROS）的產生來介導的。研究報告指出，線粒體在放大和傳遞導致產生ROS的信號方面起著核心作用。這些自由基的半衰期極短，但它們會立即與附近的分子發生反應，產生嚴重的特定部位氧化損傷，破壞細胞功能，甚至殺死細胞。在輻射產生的ROS中，-OH是一種高活性產物。據估計，輻射誘導的細胞損傷有60-70%是由-OH引起的?？茖W家們已經證明，-OH的壽命很短，在發生反應前僅能停留約9-10秒，擴散約4納米。此外，-OH造成DNA損傷只需要一毫秒的時間。遺憾的是，到目前為止，還沒有已知的-OH內源解毒系統。

氫氣是一種新型能源，最近大量研究都集中在氫氣作為儲能介質的能力上。2007年，Ohsawa等人提供的證據表明，吸入氫氣可以通過選擇性地減少-OH來保護大腦免受缺血/再灌注（I/R）損傷和中風的影響，這表明氫氣作為一種治療氣體，可以專門針對-OH發揮獨特的功能。由于-OH是輻射誘導的細胞損傷的主要原因之一，而氫氣是一種選擇性-OH清除劑，因此我們利用細胞培養和動物實驗系統研究了氫氣對輻射誘導的腸道損傷的保護作用。

材料與方法：

動物和細胞系：

雄性C57BL/6小鼠年齡為8-10周，體重為20-25克，被飼養在單獨的籠子里，置于12小時光照/黑暗循環的恒溫室中，可自由獲取食物和水。所有動物實驗均按照美國國立衛生研究院（NIH）發布的《實驗動物護理和使用指南》經第二軍醫大學動物護理和使用委員會批準。

腸上皮細胞-6（IEC-6）是一種腸隱窩上皮細胞系，取自美國模式培養物保藏中心（CRL-1592），在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的杜氏改良老鷹培養基中培養。細胞在37℃、5%CO2加濕培養箱中培養，培養基每24小時更換一次。

制備富氫鹽水（Hs）和富氫培養基（Hm）：

氫氣在生理鹽水（Ps）或培養基中高壓（0.4兆帕）溶解，使用氫氣產生裝置持續6小時使其達到飽和濃度（大于0.6毫摩爾/升）。本研究中使用的Hs和Hm是在實驗開始前制備的。氫氣微電極（MicroResp，丹麥Unisense公司）用于測量氫氣溶液和腸粘膜中的氫氣濃度。

實驗設計：

在我們的體內研究中，第一部分用于測量體重（BW）、食物攝入量和存活率。24只小鼠被平均隨機分為兩組：輻射組（Rc組，15Gy全身輻射(WR)+Ps）和輻射加氫處理組（Rh組，15Gy全身輻射+Hs）。WR前5分鐘腹腔注射Hs或Ps（10毫升/千克體重）。每天記錄小鼠的進食量和體重，直到小鼠開始死亡，并每隔24小時監測小鼠的存活率。

體內研究的第二部分旨在進行組織病理學分析和分子檢測。36只小鼠被平均隨機分為三組：Sham組（S組，無輻射但有Ps）、輻射組（Rc組，10Gy輻射+Ps）和輻射加氫處理組（Rh組，10Gy輻射+Hs）。在放射治療前5分鐘給小鼠注射Hs或Ps（靜脈注射）。三組中的六只小鼠分別在24小時和96小時接受10GyWR后安樂死。

設計了一項利用細胞培養進行的原位研究，以測量ROS的形成、細胞凋亡和存活率。在實驗過程中，細胞也被分為三組：空白組（S組，無輻射+正常培養基）、輻射組（Rc組，6Gy輻射+正常培養基）和輻射加氫處理組（Rh組，6Gy輻射+Hm）。如前所述，Rh組細胞與Hm一起在充滿富氫混合氣體的密閉容器中培養。輻照后30分鐘、6小時和24小時分別收獲輻照細胞。

放射協議：

放射中心產生的60Co-gamma射線被用作放射源。小鼠或細胞均以每分鐘1Gy的速度接受輻照。在本研究中，動物實驗使用了15Gy的致死劑量和10Gy的亞致死劑量，細胞實驗使用了6Gy的致死劑量和亞致死劑量。

檢測腸粘膜中的氫濃度：

使用氫氣微電極檢測生理鹽水、培養基和腸道組織中的氫氣濃度，該方法之前由Sun等人介紹過。