3.ZnPBA NCs的體外細(xì)胞抗氧化性能。

我們使用小鼠單核細(xì)胞RAW264.7和小鼠肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞系評(píng)估了ZnPBA NCs的體外細(xì)胞抗氧化特性。我們首先使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8評(píng)估了ZnPBA NCs的體外生物相容性。將不同濃度（0、3.125、6.25、12.5、25、50和100μg/ml）的ZnPBA NCs與RAW264.7和MRC-5細(xì)胞共孵育12、24和48小時(shí)后，它們的活力均不受影響（圖4a）。H2O2和tBHP是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的兩種常用氧化劑。細(xì)菌的脂多糖（LPS）可被細(xì)胞的TLR受體識(shí)別，引發(fā)嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量ROS。

然后，我們使用H2O2、叔丁基過(guò)氧化氫（tBHP）和LPS來(lái)激發(fā)細(xì)胞的外源性和內(nèi)源性氧化應(yīng)激。與對(duì)照組和ZnPBA+H2O2組相比，光學(xué)顯微鏡圖像顯示，僅用H2O2處理MRC-5和RAW264.7細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞上分別出現(xiàn)了明顯的凋亡體和極化現(xiàn)象。經(jīng)ROS誘導(dǎo)劑（250μM H2O2、350μM tBHP或100ng/ml LPS）處理的RAW264.7和MRC-5細(xì)胞系的存活率分別降至24.95%-44.25%和31.57%-40.81%。而與ZnPBA NCs共同孵育的細(xì)胞存活率相對(duì)較高，接近對(duì)照組。例如，在使用ZnPBA NCs（100μg/ml）對(duì)抗LPS抗原的情況下，RAW264.7和MRC-5的細(xì)胞活力分別提高到97.28±0.15%和95.17±3.80%，這表明ZnPBA NCs在對(duì)抗免疫系統(tǒng)在對(duì)抗LPS時(shí)產(chǎn)生的H2O2、tBHP等氧化物質(zhì)方面具有很高的抗氧化性能（圖4b和c）。

為了描述細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的特征，我們采用了ROS反應(yīng)熒光探針二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）來(lái)標(biāo)記H2O2處理細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS。共聚焦顯微鏡圖像顯示，經(jīng)350μM H2O2處理的RAW264.7和MRC-5細(xì)胞發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，表明細(xì)胞內(nèi)存在大量氧化應(yīng)激。在與劑量為100μg/ml的ZnPBA NCs共同作用后，熒光大大減少（圖4d）。

此外，我們使用AnnexinV-FITC/PI試劑盒評(píng)估了與H2O2和/或ZnPBA NCs共孵育后的RAW264.7和MRC-5細(xì)胞。與H2O2組明顯的細(xì)胞凋亡信號(hào)（紅色熒光）相比，ZnPBA NCs對(duì)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有很強(qiáng)的抑制作用，驗(yàn)證了ZnPBA NCs能有效緩解ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，防止細(xì)胞凋亡（圖4e）。此外，還利用流式細(xì)胞儀對(duì)不同處理的DCFH-DA染色細(xì)胞進(jìn)行了分析，以定量評(píng)估ZnPBA NCs消除氧化應(yīng)激的性能。

經(jīng)H2O2處理的RAW264.7細(xì)胞的ROS熒光強(qiáng)度平均從0.14±0.03%（未處理組）增至45.63±1.34%，表明細(xì)胞內(nèi)存在相當(dāng)強(qiáng)的氧化應(yīng)激。然而，添加ZnPBA NCs能有效緩解這種應(yīng)激，因?yàn)樵谔砑?0和100μg/ml ZnPBA NCs時(shí)，熒光強(qiáng)度分別降低到27.37±0.93%和11.2±0.24%，這進(jìn)一步驗(yàn)證了ZnPBA NCs的細(xì)胞內(nèi)氧化緩解性能（圖4f）。用AnnexinV-FITC/PI染色的RAW264.7細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)一步表明了ZnPBA NCs在緩解氧化應(yīng)激損傷和抑制細(xì)胞凋亡方面的能力。如圖4g所示，與H2O2處理組相比，經(jīng)50和100μg/ml ZnPBA NCs處理后，凋亡細(xì)胞水平分別從35.35±2.37%降至18.93±2.27%和9.97±1.09%，高度接近對(duì)照組6.37±0.26%的凋亡細(xì)胞水平。

為了弄清ZnPBA NCs如何減輕RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，我們提取了mRNA含量，以評(píng)估抗氧化、炎癥和細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。具體來(lái)說(shuō)，在檢測(cè)前，用PBS、H2O2（250μM）和H2O2（250μM）+ZnPBA NCs（100μg/ml）預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞6小時(shí)。收獲細(xì)胞并進(jìn)行mRNA分析。與對(duì)照組相比，H2O2處理組的抗氧化相關(guān)mRNA（包括SOD1、SOD2、GPX4和CAT）分別上調(diào)了1.3、0.8、1.2和1.1倍，表明細(xì)胞內(nèi)抗氧化機(jī)制被激活。然而，在ZnPBA NCs+H2O2組中，這些mRNA的相應(yīng)細(xì)胞表達(dá)量大部分被下調(diào)，這可能與ZnPBA NCs的顯著抗氧化作用有關(guān)（圖4h）。

同樣，與H2O2處理組相比，用ZnPBA NCs處理的細(xì)胞中NF-κB mRNA的表達(dá)也有所下降（圖4i）。先前的研究表明，細(xì)胞內(nèi)Zn2+的增加會(huì)促進(jìn)A20的表達(dá)，A20是一種鋅指蛋白，是TNFR和TLR激活NF-κB途徑中的主要負(fù)調(diào)控因子。因此，細(xì)胞內(nèi)Zn2+離子在炎癥下調(diào)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，從而抑制了炎癥性先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等。此外，氧化應(yīng)激介導(dǎo)的損傷指標(biāo)以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的相關(guān)mRNA（如BAX、BAK1、APAF1和caspase-3）在H2O2組中上調(diào)，表明RAW264.7在H2O2刺激下的細(xì)胞凋亡途徑。

然而，在H2O2之后使用ZnPBA NCs處理細(xì)胞（H2O2+ZnPBA NCs組），可以觀察到這些mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，具體證實(shí)了ZnPBA NCs可以有效緩解細(xì)胞的氧化應(yīng)激，從而阻斷細(xì)胞凋亡過(guò)程（圖4j）。綜上所述，ZnPBA NCs優(yōu)異的體外生物相容性和ROS清除活性得到了驗(yàn)證，表明其在抗氧化/炎癥基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，在抗氧化催化的前沿領(lǐng)域具有廣闊的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。