結(jié)果與討論：

1.ZnPBA NCs的合成與表征。

ZnPBA NCs是在聚乙烯吡咯烷酮的保護(hù)下，通過氯化鋅和鐵氰化鉀在水溶液中的簡單自組裝合成的。經(jīng)過透析純化后，ZnPBA NCs被濃縮并重新分散以備進(jìn)一步使用（圖2a）。從透射電子顯微鏡（TEM）圖像來看，合成的ZnPBA NCs形狀均勻，分散良好，直徑為5-15nm，從DLS技術(shù)來看，其平均水動(dòng)力直徑為17.8±0.6nm（圖2b）。此外，我們還通過DLS測量了分散在水和鹽水中的ZnPBA NCs在7天內(nèi)的尺寸變化。我們發(fā)現(xiàn)，ZnPBA NCs在水和鹽水中具有生理穩(wěn)定性，納米粒子的尺寸沒有明顯變化。

此外，能量色散X射線光譜（EDS）還證實(shí)了C、Fe、Zn的元素組成，原子比為1.48:2.95:1。特別是在EDS分析中，ZnPBA NCs中鐵/鋅的摩爾比為1.07:1。接下來，我們利用X射線衍射技術(shù)揭示了合成ZnPBA NCs的相結(jié)構(gòu)。如圖2c所示，位于14.85?、17.18?、24.39?、34.80?和39.04?的2θ度處的幾個(gè)強(qiáng)衍射峰分別對應(yīng)于(111)、(200)和(300)晶格平面。04?可分別表示為(111)、(200)、(220)、(400)和(420)的晶格面，這與Zn3[Fe(CN)6]2?4/3H2O的標(biāo)準(zhǔn)衍射圖樣（JCPDS）非常吻合。

從傅立葉變換紅外光譜來看，1279cm處的峰值可歸因于C-N振蕩，而1660cm處的強(qiáng)峰值則表明吡咯烷酮環(huán)存在C-O伸縮振動(dòng)吸收。此外，在2103cm處可以觀察到強(qiáng)烈的紅外吸收，這是C-N鍵的特征（圖2e）。X射線光電子能譜（XPS）進(jìn)一步研究了ZnPBA NCs的化學(xué)成分和結(jié)合結(jié)構(gòu)。根據(jù)ZnPBA NCs的掃描光譜（圖2f），可以檢測到包括Zn、Fe、K、C、N和O在內(nèi)的主要元素，并對其原子濃度進(jìn)行了半定量測定，如圖2f插入的表格所示。為了進(jìn)一步研究鐵和鋅的價(jià)態(tài)，還記錄了這些元素的高分辨率光譜。位于710.9eV和722.5eV的峰可以分配給Fe2p3/2和Fe2p1/2物種。在707.5eV的峰值顯示了Fe2+的存在，而在1022.6eV和1024.9eV的峰值對應(yīng)于二價(jià)鋅陽離子（圖2g-h），表明鋅離子為+2價(jià)，而鐵離子為+2/+3混合價(jià)。上述光譜事實(shí)進(jìn)一步證實(shí)了氯化鋅、鐵氰化鉀和PVP聚合物成功地組裝到了ZnPBA NCs上，形成了Zn3[Fe(CN)6]2的一般組成。

2.ZnPBA NCs的抗氧化性能。

在細(xì)菌性肺炎中，巨噬細(xì)胞呼吸猝滅滲入造成的ROS超載是誘導(dǎo)正常細(xì)胞/組織氧化損傷的主要因素，并引發(fā)細(xì)胞凋亡，被稱為急性肺損傷。合成ZnPBA NCs對ROS具有抗氧化活性主要基于兩個(gè)方面：1）ZnPBA NCs類似于普魯士藍(lán)（PB）結(jié)構(gòu)的高還原電位：ZnPBA NCs在有-OH和H2O2等氧化物存在時(shí)可被氧化成柏林綠（BG）或普魯士黃（PY），從而消除這些ROS。在清除有毒自由基（O2-、H2O2）方面具有類似過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的抗氧化性能。

本研究考慮了三種主要的ROS（如H2O2、超氧陰離子和-OH）來驗(yàn)證ZnPBA NCs的抗氧化性能（圖3a）。黃嘌呤氧化酶（XO）是一種催化黃嘌呤（X）轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤并伴隨產(chǎn)生超氧陰離子自由基的酶。超氧陰離子自由基是人體內(nèi)壽命最短的自由基之一，可對細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害。在生理學(xué)上，超氧陰離子自由基可被細(xì)胞內(nèi)的超氧化物歧化酶清除，該酶可將自由基分解為毒性較低的H2O2和O2。為了研究超氧陰離子自由基的消除，我們采用XO+X系統(tǒng)來刺激超氧陰離子自由基的產(chǎn)生。利用超氧化物歧化酶活性試劑盒，我們發(fā)現(xiàn)ZnPBA NCs在試驗(yàn)中表現(xiàn)出劑量依賴性的高超氧化物歧化酶模擬催化活性。在濃度為100μg/ml時(shí)，ZnPBA NCs能有效清除81.18±4.84%的超氧化物，計(jì)算得出ZnPBA NCs的中位有效濃度（EC50）為14.49±0.36μg/ml（圖3b）。電子順磁共振（EPR）光譜被用來驗(yàn)證ZnPBA NCs在XO+X系統(tǒng)中清除超氧陰離子的能力。

生成的超氧陰離子被5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）捕獲，形成自由基加合物DMPO-OOH和相應(yīng)的EPR信號(hào)。加入ZnPBA NCs后，可以觀察到超氧陰離子的特征峰明顯減少，驗(yàn)證了ZnPBA NCs清除超氧陰離子的性能（圖3c）。此外，過氧化氫是一種壽命相對較長的非自由基ROS，經(jīng)常作為超氧化物歧化的下游產(chǎn)物而產(chǎn)生。細(xì)胞內(nèi)積累的過氧化氫可根據(jù)其濃度發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。相對低濃度的H2O2可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高濃度的H2O2則可能會(huì)損傷細(xì)胞。為了評估ZnPBA NCs分解H2O2的性能，我們測量了在固定濃度的H2O2（10mM）下與不同濃度（0、25、50和100μg/ml）的ZnPBA NCs共同培養(yǎng)期間的溶解氧水平。在15分鐘的測量過程中，可以觀察到溶解氧濃度的增加呈正向ZnPBA NCs劑量相關(guān)性，這表明ZnPBA NCs具有類似CAT的活性（圖3d）。此外，還采用了TMB發(fā)色法進(jìn)一步定量檢測-OH清除活性，從中可以看出TMB發(fā)色產(chǎn)物明顯減少。當(dāng)與更高濃度的ZnPBA NCs共孵育時(shí)，652nm處顯色動(dòng)力學(xué)的初始速度逐漸降低，表明ZnPBA NCs可以通過消除OH-來抑制TMB顯色動(dòng)力學(xué)（圖3e）。

計(jì)算得出的-OH抑制率在ZnPBA NCs濃度為20μg/ml時(shí)達(dá)到57.19±3.69%，在濃度升至160μg/ml時(shí)進(jìn)一步提高到90.08±9.32%（圖3f）。接下來，我們利用EPR光譜鑒定了DMPO捕集劑存在時(shí)的-OH清除性能。在弱酸性環(huán)境下，可以觀察到FeSO4（20μM）和H2O2（2.5mM）之間的Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的-OH光譜信號(hào)（振幅為1:2:2:1）。加入ZnPBA NCs（100μg/ml）可有效減弱-OH的光譜信號(hào)，驗(yàn)證了ZnPBA NCs強(qiáng)大的-OH清除能力（圖3g）。通過檢測ZnPBA NCs與H2O2反應(yīng)過程中的溶解氧濃度，ZnPBA NCs在不同溫度（20?C至50?C）和pH值（4.0至10.0）條件下均表現(xiàn)出較高的CAT模擬活性。溫度的升高在很大程度上加速了H2O2（含或不含ZnPBA NCs）的分解（圖3h和i）。上述結(jié)果證明，ZnPBA NCs在溫度、pH值和底物濃度范圍較寬的條件下對ROS具有穩(wěn)定高效的抗氧化催化活性。